موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 3:51 دقيقة • July 8th, 2025
خذ مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة في طبق متعدد الآبار يحتوي على وسائط.
استبدل نصف الوسائط في بئر الاختبار بوسائط تحتوي على جزيئات نانوية من الفضة ، وفي بئر التحكم بوسائط السيارة. حضن.
تستوعب الخلايا الدبقية الصغيرة الجسيمات النانوية ، وتنشط ، وتطلق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات.
انقل وسائط السيارة والوسائط المكيفة التي تحتوي على هذه السيتوكينات إلى مرشحات مثبتة على أنابيب التجميع.
جهاز طرد مركزي لإزالة الجسيمات النانوية ، والاحتفاظ بالسيتوكينات.
اقلب المرشحات إلى أنابيب تجميع جديدة ، وأجهزة طرد مركزي ، واجمع الوسائط. أضف وسائط جديدة.
بعد ذلك ، خذ الثقافات العصبية تحت المهاد.
استبدل نصف وسائط بئر التحكم بوسائط السيارة ووسائط بئر الاختبار بوسائط مكيفة. حضن.
ترتبط السيتوكينات بالمستقبلات الموجودة على الخلايا العصبية تحت المهاد ، مما ينشط مسارات الإشارات التي تحفز موت الخلايا العصبية.
أضف ريزازورين واحتضن.
في الخلايا الحية ، تقلل إنزيمات نازعة الهيدروجين من الريزازورين الفلوري الضعيف إلى ريسوروفين الفلورسنت.
قياس التألق.
يشير انخفاض التألق إلى زيادة موت الخلايا العصبية تحت المهاد ، مما يشير إلى السمية العصبية الناجمة عن الجسيمات النانوية.
للبدء ، اجمع 200 ميكرولتر من الوسط الطافي من كل لوح جيدا ، وقم بتحميله على مرشح يزيل الجسيمات النانوية ، الموضوعة فوق أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
من المهم أن تتذكر أنه عند تصفية الجسيمات النانوية ، سيؤثر حجمها وشكلها وتركيزها على كفاءة الترشيح ، لذلك ينصح باختبار الترشيح مسبقا.
الآن ، قم بتدوير الأنابيب عند 14,000 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، تخلص من التدفق ، الذي يحتوي على الجسيمات النانوية ، وضع المرشحات رأسا على عقب في أنابيب تجميع جديدة. قم بتدوير المرشحات رأسا على عقب عند 1,000 جم لمدة دقيقتين لجمع وسط مركز ومكيف يحتوي على السيتوكينات.
بعد ذلك ، قم بزيادة حجم المجموعة إلى 400 ميكرولتر باستخدام DMEM المكملات الطازجة وقم بتخزين الأنابيب على الثلج. لهذا الفحص ، قم بإنشاء خلايا تحت المهاد من المخزونات المجمدة باستخدام نفس الطرق الموصوفة لإنشاء مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة. في النهاية ، استخدمها لزرع ألواح ذات جدران سوداء وذات قاع شفاف تحتوي على 5000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من DMEM المكملة.
بعد 24 ساعة من الاستزراع ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط واستبدله ب 100 ميكرولتر من الوسط المفلتر والمركز الذي تم جمعه من مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة. ثم احتضن اللوحة لمدة 24 ساعة في ظل الظروف القياسية. في اليوم التالي ، أضف 22 ميكرولترا من كاشف الريزازورين إلى كل بئر ، واستمر في الحضانة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي متعدد الأوضاع ، خذ مقياسا مضنوعا لتقدير صلاحية الخلية من حيث وحدات التألق النسبية.