موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 3:45 دقيقة • July 8th, 2025
خذ البلازميد المطلوب في وسائط خالية من المصل. يقوم هذا البلازميد بتشفير البروتينات الخاصة بالحويصلة بعلامات الفلورسنت.
في أنبوب آخر ، خذ كاشف النفقة المخفف في وسائط خالية من المصل.
امزج الحلين واحتضن.
يتحد كاشف التعدي مع البلازميد ، ويشكل مركبا.
خذ بئر يحتوي على الخلايا العصبية الملتصقة في وسائل الإعلام باستخدام المصل. أضف المجمعات واحتضنها. يسهل المركب دخول البلازميد إلى الخلية.
تجاهل الوسائط لإزالة المجمعات غير الداخلية.
أضف وسائط جديدة ثم احتضنها.
يدخل البلازميد إلى النواة المراد نسخها ثم يترجم إلى بروتينات فلورية خاصة بالحويصلة تصنف الحويصلات في الخلايا العصبية.
باستخدام مجهر مضان تحت درجة حرارة خاضعة للرقابة ، احصل على صور على فترات زمنية محددة.
لتحليل الصور، حدد معلمات التتبع.
حدد الحويصلة محل الاهتمام وسجل إحداثياتها في كل صورة.
قم بتجميع البيانات لتصور حركة الحويصلة.
في هذا الإجراء ، امزج 4 ميكروغرامات من البلازميد مع 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. في أنبوب منفصل ، قم بتخفيف ثمانية ميكرولترات من كاشف النفقة في 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. ثم احتضن المحلول لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، اخلطي محلول البلازميد ومحلول كاشف الإرسال ، واحتضن الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضيفي الخليط إلى أطباق القاع الزجاجي المطلي.
احتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل الوسط ب 2 مل من وسط الثقافة القشرية الدماغية ، واحتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين.
للتصوير ، استخدم مجهر مضان مزود بكاميرا CCD مع عدسات موضوعية 40x. حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام نظام الحضانة. احصل على صور الخلايا العصبية في إطار واحد كل 5 ثوان خلال فترة 100 ثانية يتحكم فيها برنامج الحصول على الصور.
لتحليل الصور ، افتح جميع الصور المتسلسلة في برنامج ImageJ مع التتبع اليدوي. لدمج الصور المتسلسلة ، اختر صورة ، ثم مكدسات متبوعة بالصور للتكديس ، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك ، اختر الإضافات ، ثم التتبع اليدوي. ستظهر نافذة تتبع. انقر فوق مربع الاختيار إظهار المعلمات ، وحدد معلمات التتبع في قسم المعلمات.
ثم انقر على إضافة مسار لبدء مسار جديد. بعد تحديد الحويصلات ذات الأهمية ، انقر فوق مركز الإشارات في الصور المتسلسلة لتسجيل إحداثيات XY. كرر هذا الإجراء لجمع إحداثيات XY للحويصلات من جميع الصور المتسلسلة. تتقدم كل صورة تلقائيا إلى الصورة المتتالية بعد تحديد النقطة المرجعية.