القياس الكمي لتوزيع بروتين ما قبل المشبكي في دماغ الفأر باستخدام التألق المناعي

خذ شريحة دماغ فأر ثابتة كيميائيا مدمجة في وسط تضمين الأنسجة.

اغسل الشريحة بمحلول عازل لإزالة الوسط.

أضف محلولا يتخلل الأغشية ويمنع مواقع الربط غير المحددة.

قم بإزالة المحلول.

لتصور البروتينات المشبكية العصبية ، احتضان الشريحة بالأجسام المضادة الأولية.

تستهدف هذه الأجسام المضادة بروتينا قبل المشبكي يتم التعبير عنه في نقاط الاشتباك العصبي لمناطق معينة من الدماغ وبروتين متشابك يتم التعبير عنه في كل مكان كعلامة مرجعية.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

إدخال الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور والتي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.

قم بتلطيخ النوى بصبغة ملزمة للحمض النووي.

اغسل بالمخزن المؤقت وقم بتركيب الشريحة باستخدام وسيط تركيب مناسب.

تصور الشريحة تحت مجهر متحد البؤر.

احسب متوسط نسب شدة التألق للبروتين المستهدف والعلامة المرجعية لتحليل توزيع البروتين المستهدف عبر مناطق الدماغ المختلفة.

لتحضير الشرائح للتلوين المناعي ، استخدم ماصة بلاستيكية لإزالة محلول PB من بئر واحد دون سحب شرائح الدماغ. بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإضافة 250 ميكرولتر من PB الطازج لغسلها من OCT الزائد. كرر هذا الغسيل لكل بئر في ذلك الوقت لتجنب جفاف الشرائح.

بعد ذلك، استخدم ماصة بلاستيكية لإزالة محلول PB من البئر