القياس الكمي لتوزيع بروتين ما قبل المشبكي في دماغ الفأر باستخدام التألق المناعي

خذ شريحة دماغ فأر ثابتة كيميائيا مدمجة في وسط تضمين الأنسجة.

اغسل الشريحة بمحلول عازل لإزالة الوسط.

أضف محلولا يتخلل الأغشية ويمنع مواقع الربط غير المحددة.

قم بإزالة المحلول.

لتصور البروتينات المشبكية العصبية ، احتضان الشريحة بالأجسام المضادة الأولية.

تستهدف هذه الأجسام المضادة بروتينا قبل المشبكي يتم التعبير عنه في نقاط الاشتباك العصبي لمناطق معينة من الدماغ وبروتين متشابك يتم التعبير عنه في كل مكان كعلامة مرجعية.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

إدخال الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور والتي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.

قم بتلطيخ النوى بصبغة ملزمة للحمض النووي.

اغسل بالمخزن المؤقت وقم بتركيب الشريحة باستخدام وسيط تركيب مناسب.

تصور الشريحة تحت مجهر متحد البؤر.

احسب متوسط نسب شدة التألق للبروتين المستهدف والعلامة المرجعية لتحليل توزيع البروتين المستهدف عبر مناطق الدماغ المختلفة.

لتحضير الشرائح للتلوين المناعي ، استخدم ماصة بلاستيكية لإزالة محلول PB من بئر واحد دون سحب شرائح الدماغ. بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإضافة 250 ميكرولتر من PB الطازج لغسلها من OCT الزائد. كرر هذا الغسيل لكل بئر في ذلك الوقت لتجنب جفاف الشرائح.

بعد ذلك، استخدم ماصة بلاستيكية لإزالة محلول PB من البئر الأول. استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإضافة 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل بئر، وتعمل بشكل جيد مرة أخرى. احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة ثلاث ساعات. أثناء الحضانة عند 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة لكل بئر إلى أنبوب التفاعل.

بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 2 ميكرولتر لإضافة الكمية المناسبة من الجسم المضاد، وسحب ماصتها مباشرة في المحلول، وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط. ثم قم بتدوير هذا الجسم المضاد المخفف لضمان الخلط المناسب.

العمل بشكل جيد بشكل جيد ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع بماصة بلاستيكية وأضف 250 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر. احتضن الطبق على شاكر عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد بماصة بلاستيكية. اغسل الشرائح ب 300 ميكرولتر من محلول الغسيل 1 لكل بئر ، ثلاث مرات 10 دقائق كل غسلة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. أثناء الغسيل ، العمل في الظلام ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المقترن بالفلوروفور في أنبوب تفاعل بنفس الطريقة التي تم القيام بها سابقا مع الجسم المضاد الأساسي.

بعد الانتهاء من الغسيل ، قم بإزالة عازلة الغسيل بماصة بلاستيكية وأضف 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. بعد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد بماصة بلاستيكية. اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام عازلة الغسيل 2 بنفس الطريقة كما هو الحال مع مخزن الغسيل 1.

أثناء هذا الغسيل ، قم بتخفيف بقعة DAPI في 0.1 مولار PB لتحقيق تركيز من 1 إلى 2000. بعد إزالة عازلة الغسيل من اللوحة ، أضف 250 ميكرولتر من محلول DAPI ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة على الخلاط لمدة 5 دقائق.

بعد إزالة محلول DAPI بماصة بلاستيكية، استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإضافة 500 ميكرولتر من 0.1 مولار PB لكل بئر. ضع شريحة مجهر تحت مجسم الطباعة. استخدم فرشاة دقيقة لإضافة ثلاث قطرات منفصلة من 0.1 molar PB على الشريحة. باستخدام الفرشاة ، ضع شريحة واحدة لكل قطرة على الشريحة ، ثم قم بتسطيح الشرائح وتوجيهها.

بعد وضع جميع الشرائح بشكل صحيح ، استخدم منديلا ورقيا لإزالة PB الزائد وجففه بعناية دون تجفيف الشرائح تماما. بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولترا من وسيط التضمين على الشريحة ، وقم بتغطيتها بعناية بغطاء لتضمين شرائح الدماغ.

قم بتغطية الشرائح لتجنب التعرض للضوء واتركها لتجف في غطاء الدخان لمدة ساعة إلى ساعتين ، ثم قم بتخزينها في صندوق منزلق مجهر عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للفحص المجهري متحد البؤر.

بعد الحصول على أنسجة افتراضية لشريحة الدماغ بأكملها لقنوات مختلفة كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتحميل جميع القنوات الفردية لصورة واحدة في فيجي بالنقر فوق ملف ثم فتح. بعد ذلك ، استخدم أداة التحديد اليدوي لتحديد نصف كرة واحد في قناة DAPI. انقر فوق تحرير ، ثم تحديد ، ثم قم بإنشاء قناع لإنشاء قناع للمنطقة المحددة.

ثم انقر فوق تحليل ، ثم قياس الجسيمات لتحديد متوسط شدة التألق للقنوات الفردية ، مع التأكد من تحديد قنوات مختلفة لتحديد متوسط قيم شدة التألق لكل قناة.

بعد ذلك ، انسخ متوسط شدة التألق للقنوات المفردة في جدول بيانات. لتحديد متوسط شدة التألق للقنوات المفردة في منطقة الاهتمام ، حدد المنطقة باستخدام أداة الاختيار اليدوية.