تلطيخ الفلورسنت المناعي للبروتينات السكرية في الخلايا السلفية العصبية والخلايا العصبية

خذ الخلايا الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلفية والخلايا العصبية ، التي تحتوي على البروتينات السكرية السيالوبروتينية الموسومة بواسطة مراسل حمض السياليك.

أضف بارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا. قم بإزالة البارافورمالدهيد الزائد باستخدام المخزن المؤقت.

احتضان بخليط تفاعل يحتوي على مجسات كيميائية قائمة على البيوتين ، وعامل اختزال ، ومحفز معدني.

ينشط العامل المختزل المحفز ، مما يسهل بيوتينيل البروتينات

السكرية.

يرفع خليط التفاعل ويغسل بمخزن مؤقت. أضف الستربتافيدين المترافق بالفلوروفور لربط البروتينات السكرية السيالوتينية.

قم بإزالة الستربتافيدين غير المرتبط واغسله بمحلول مؤقت. أضف البروتينات والمنظف غير الأيوني لمنع المواقع غير المحددة واختراق الخلايا.

قم بإزالة هذا المحلول واحتضانه بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتينات خلوية معينة.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور وصبغة الفلورسنت لربط الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتين وتسمية النوى.

إزالة الجزيئات غير المرتبطة. يغسل مع العازلة.

باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، قم بتصوير الخلايا لتصور البروتينات السكرية الفلورية والبروتينات الخلوية.

أولا ، قم بإزالة الإدخالات من ألواح الزراعة المشتركة ، واستنشق وسط الثقافة من قاع الآبار. بعد ذلك ، اغسل الخلايا العصبية مرة واحدة باستخدام PBS الدافئ مسبقا. قم بشفط PBS من الآبار ، وأضف 1 مليلتر من 4٪ بارافورمالدهيد مبرد مسبقا في PBS إلى كل بئر.

ثبت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد. استنشق PBS ، وأضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت المترافق مع البيوتين المحضر حديثا في كل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت للتفاعل من الآبار ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 1 مليلتر من مخزن التلوين إلى كل بئر من الخلايا ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت للتلوين من الآبار ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا. أضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل بئر من الخلايا ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت للانسداد من الآبار ، وأضف 1 مليلتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر. احتضان الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأولية من الآبار. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد. استنشق PBS من الآبار ، وأضف 1 مليلتر من الجسم المضاد الثانوي لكل بئر. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بشفط المحلول من الآبار ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد.