التقييم في المختبر ل β الأميلويد المجمعة على انهيار مخروط نمو الخلايا العصبية

ابدأ بشريحة ثقافة متعددة الآبار تحتوي على خلايا عصبية من جنين فأر في وسط.

تظهر الخلايا العصبية مخاريط النمو عند أطراف محاورها المتنامية. تشتمل هذه الهياكل على نتوءات رفيعة تسمى filopodia وامتدادات تشبه الألواح تسمى lamellopodia ، والتي تتكون من خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة ، وهي مكونات الهيكل الخلوي.

عالج آبار الاختبار ببروتين β الأميلويد المجمع، أو Aβ، وآبار التحكم بمحلول السيارة.

في آبار الاختبار ، يرتبط Aβ المجمعة بمستقبلات الغشاء ، مما يؤدي إلى بدء إشارات المصب التي تعمل على فسفرة البروتينات المنظمة للهيكل الخلوي.

تعطل البروتينات الفسفرة خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة ، مما يزعزع استقرار السلامة الهيكلية لمخروط النمو ويسبب انهياره.

احتضان بمثبت للحفاظ على البنية الخلوية ، ثم اغسل الخلايا وقم بتركيبها للتصوير.

باستخدام المجهر ، قارن الهياكل الخلوية في آبار الاختبار والتحكم.

يشير الحدوث المتزايد لانهيار مخروط النمو في الخلايا العصبية المعالجة ب Aβ إلى التأثير السام لمجاميع Aβ.

ابدأ هذا الاختبار قبل أسبوع على الأقل عن طريق فتح قارورة جديدة من A-beta-42 كامل الطول الذي تم الحصول عليه تجاريا وإذابة المحتويات في الماء المقطر المعقم بتركيز 0.5 ملليمول. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام للحث على التراكم والسمية. قم بإعداد حصص من A-beta-42 المجمعة ، وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام.

في اليوم الرابع من الثقافة العصبية ، عالج الآبار ب 100 ميكرولتر من 0.5 ميكرومولار مجمعة A-beta-42 أو محلول السيارة في متوسط B لمدة ساعة واحدة كما هو موضح سابقا. بعد انقضاء الساعة ، قم بإزالة وسط الثقافة ، وقم على الفور بإصلاح الخلايا العصبية بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد تحتوي على 4٪ سكروز في PBS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية على صفيحة ساخنة.

التثبيت مهم في الغالب لأن الحفاظ على شكل مخاريط النمو أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول.

بعد التثبيت ، اغسل الخلايا العصبية ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم ، بعد إزالة الغرفة ، قم بتركيب الخلايا العصبية بوسط تركيب مائي. جفف وسط التركيب عند 4 درجات مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام. التقط مساحة كل بئر بالكامل باستخدام عدسة موضوعية جافة 20x على مجهر مقلوب.

يعد

التقاط وتحليل المنطقة بأكملها في كل بئر أمرا مهما لتجنب الذاتية.

تصنيف أطول الخلايا العصبية لكل خلية عصبية في المرحلة 3 أو 4 كمحاور عصبية. تعتبر مخاريط النمو المحورية التي تفتقر إلى صفيحة الأرجل أو تمتلك أقل من ثلاثة مخاريط نمو منهارة.