تصور ببتيدات أميلويد بيتا في شرائح الدماغ القشرية البشرية

خذ شريحة زجاجية تحتوي على شريحة قشرية من أنسجة المخ تم جمعها من مريض الزهايمر. يحتوي النسيج على رواسب أميلويد بيتا غير القابلة للذوبان داخل الحمة والشعيرات الدموية الدماغية.

اغمر الشريحة في الكحول المخفف لإزالة الدهون والأملاح.

اغسل بالكحول المطلق لتجفيف الأنسجة ، ثم ضع مثبتا للحفاظ على بنية الأنسجة.

جفف الشريحة بالمكنسة الكهربائية ، وإزالة أي رطوبة.

عالج ببخار حمض الفورميك في بيئة رطبة لتكسير مجاميع الأميلويد بيتا إلى ببتيدات قابلة للذوبان أصغر.

باستخدام ماسح ضوئي ، قم بإنشاء صور للسمات الهيكلية للأنسجة لتفسير البيانات من قياس الطيف الكتلي للتصوير.

رش محلول مصفوفة على العينة.

باستخدام مطياف الكتلة ، قم بتطبيق ليزر تمتصه المصفوفة لتأين الببتيدات. ثم يحددها الكاشف بناء على نسبة الكتلة إلى الشحن.

تحليل البيانات لإنتاج الصور ، والكشف عن توزيع ببتيدات الأميلويد بيتا في حمة الأنسجة والشعيرات الدموية الدماغية.

لشطف أقسام الأنسجة ، اغمر العينات في 40 إلى 100 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ في وعاء تلطيخ زجاجي لمدة 30 ثانية لإزالة الدهون الذاتية والأملاح غير العضوية. اغسل العينات باستخدام تسلسل الغسيل المدرج في بروتوكول النص. ثم جفف العينات في فراغ لمدة 30 دقيقة.

الآن ، عالج أقسام الأنسجة ببخار حمض الفورميك للحصول على تأين أفضل لبروتينات الأميلويد بيتا من أنسجة الدماغ لتشريح الجثة. للقيام بذلك ، قم بإعداد الفرن على حرارة 60 درجة مئوية وطبق زجاجي حضانة يحتوي على 5 مل من حمض الفورميك 100٪. حافظ على رطوبة الهواء في طبق زجاج الحضانة عند مستوى التشبع.

ضع شرائح الأنسجة في طبق زجاج الحضانة مع تجنب الغمر في حمض الفورميك وعالجها لمدة ست دقائق. التقط صورة بصرية للعينات باستخدام ماسح ضوئي للأفلام أو ماسح ضوئي هلامي أو مجهر رقمي. قم بتنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة.

تعد

محاذاة الصورة البصرية للعينات ضرورية عند وضع هدف العينة داخل الجهاز. عادة ، لن يكون من الممكن التعرف على قسم الأنسجة أسفل طبقة المصفوفة. لربط الصور البصرية بالعينات، قم بعمل علامات إرشادية مرئية في كل من الصورة البصرية وأسفل طبقة المصفوفة في الكاميرا البصرية. أسهل طريقة هي تحديد ثلاث علامات سائل تصحيح على الأقل حول العينة قبل التقاط الصورة البصرية.

لرش المصفوفة باستخدام بخاخ بالموجات فوق الصوتية ، قم بإزالة الأنسجة المراد رشها من المجفف ، وضعها في الغرفة. تأكد من أن الأنسجة لا تغطي نافذة المستشعر. ابدأ التحضير بالضغط على زر البدء. عادة ما يكون وقت التحضير حوالي 90 دقيقة.

سيتم تنظيم التحضير تلقائيا من خلال مراقبة سمك طبقة المصفوفة والبلل. بدلا من ذلك ، لرش محلول المصفوفة على سطح الأنسجة باستخدام بخاخ أوتوماتيكي ، استخدم نظام مضخة المذيبات مضبوطة على 10 رطل لكل بوصة مربعة و 0.15 مل في الدقيقة لتقديم محلول المصفوفة.

سيتم تسليم تدفق مستمر لغاز الغلاف الساخن جنبا إلى جنب مع رذاذ محلول المصفوفة. قم بإجراء تجارب تصوير عالية الإنتاجية وعالية الدقة المكانية باستخدام MALDI-IMS. لقياسات قياس الطيف الكتلي ، حدد مناطق الأنسجة باستخدام برنامج التحكم MALDI وبرنامج تحليل البيانات.

اكتساب الأطياف في الوضع الخطي الموجب مع نطاق نسبة الكتلة إلى الشحنة من 2,000 إلى 20,000 ودقة مكانية تبلغ 20 و 100 ميكرون. لعمل معيار المعايرة ، قم بإذابة معيار معايرة الببتيد في معيار معايرة البروتين بنسبة 1 إلى 4 مع CHCA في محلول TA30 ، ثم قم بتخفيفه 10 مرات.

ضع 1 ميكرولتر من معيار المعايرة على الشريحة في أربعة مواقع مختلفة. باستخدام برنامج علم الأنسجة الجزيئية ، قم بتراكب صور إشارة متعددة للعثور على الارتباط المكاني للإشارات المختلفة ، مثل ببتيدات الأميلويد بيتا المختلفة التي تشارك في توطينها في لويحات الشيخوخة في جدران الشرايين.