$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ابدأ بغطاء يحتوي على خلايا عصبية مستنبتة تعبر عن بروتينات غشاء الحويصلة المشبكية ، بما في ذلك synaptophysin الموسوم بالفلورسنت و synaptotagmin-1.
قم بإزالة الوسط ، وأضف مزيجا من المخزن المؤقت لإزالة الاستقطاب والأجسام المضادة الأولية ، ثم احتضانه.
تدخل الأيونات العازلة إلى الخلايا ، مما يحفز اندماج الحويصلات المشبكية مع الغشاء ، مما يكشف عن synaptotagmin-1.
ترتبط الأجسام المضادة الأولية بشكل انتقائي ب synaptotagmin-1 المكشوف.
تخلص من المخزن المؤقت واغسله بالوسيط لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
أدخل وسيطا جديدا واحتضانه لتسهيل استيعاب الغشاء ، وتشكيل حويصلات معاد تدويرها مع synaptophysin المسمى و synaptotagmin-1 المرتبط بالأجسام المضادة.
قم بإزالة الوسط ، وإصلاح الخلايا ، وغسلها.
أدخل حاجزا حاجب قائم على المنظفات مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بالفلوروفور.
يتخلل المنظف الخلايا ، مما يسمح للأجسام المضادة الثانوية بالتفاعل مع synaptotagmin-1 المرتبط بالأجسام المضادة.
ارفع الغطاء واغسله بالماء وجففه.
ضع الغطاء مقلوب ووجهه لأسفل على شريحة مع وسيط تضمين للتحليل البصري للحويصلات المعاد تدويرها ذات الملصقات المزدوجة.
قم بتسخين 600 ميكرولتر من 1x عازلة إزالة الاستقطاب و 10 مل من وسط زراعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر المضاد ل SYT1 إلى المخزن المؤقت لإزالة الاستقطاب 1x والدوامة لمدة 10 ثوان. بعد إزالة وسيط زراعة الخلية والتخلص منه من الخلايا ، أضف 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لإزالة الاستقطاب إلى كل بئر.
احتضن الطبق لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الحاضنة. قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة لإزالة الاستقطاب والتخلص منه وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسط زراعة الخلايا. أضف 1 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر واحتضانه لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
ثم قم بإزالة 750 ميكرولتر من الوسط وأضف نفس الكمية من الوسط الطازج. كرر هذه العملية ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإزالة وسيط زراعة الخلايا والتخلص منه وإضافة 300 ميكرولتر من 4٪ PFA في 1x PBS.
أخيرا ، احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل غسلها ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع كل منها 1x PBS. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المقترن بالفلوروفور في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لكل بئر عند تخفيف من 1 إلى 1,000. قم بإزالة وتخلص من 1x PBS من كل بئر يحتوي على أغطية مع الخلايا العصبية المستنبتة.
أضف 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة العازلة إلى كل بئر ، واحتضنه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 1 مليلتر من 1x PBS.
بعد ذلك ، أضف قطرة سعة 7 ميكرولتر من وسط التضمين على شريحة المجهر. قم بإزالة الغطاء من اللوحة المكونة من 24 بئرا عن طريق رفعها بقنية والإمساك بها بالملقط. اغمس الغطاء في الماء المقطر لإزالة PBS ، وجففه بعناية عن طريق لمس حافة واحدة بمنديل ناعم.
اقلب الغطاء على قطرة متوسط التضمين بحيث يواجه السطح الذي يحمل الخلايا شريحة المجهر ، وبالتالي تضمين الخلايا في وسط التضمين. اترك الشرائح لتجف تحت غطاء المحرك لمدة ساعة إلى ساعتين ، مع تغطيتها لتجنب التعرض للضوء. قم بتخزين الشرائح المجففة في صندوق منزلق مجهر عند 4 درجات مئوية.