قياس تنشيط مستقبلات الرائحة باستخدام مقايسة الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري في الوقت الحقيقي

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا ثدييات منقولة.

تعبر هذه الخلايا عن مستقبل الرائحة للخلايا العصبية الشمية (OR) ، وهو مستقبل مقترن ببروتين G ، جنبا إلى جنب مع مستشعر حيوي cAMP يحتوي على مجال ربط cAMP مدمج في لوسيفيراز متحور.

قم بإزالة الوسط واغسله بمخزن مؤقت لإزالة الوسط المتبقي.

أضف مخزن مؤقت يحتوي على ركيزة مستشعر حيوي cAMP. احتضان لتسهيل امتصاص الركيزة في الخلايا.

باستخدام قارئ لوحة التلألؤ الكيميائي ، قم بقياس اللمعان القاعدي للخلايا.

أضف تركيزات متزايدة من رائحة الاختبار إلى الآبار ، مع ترك بئر واحد دون معالجة كعنصر تحكم.

يرتبط الرائحة بغرفة العمليات ويطلق سلسلة إشارات تنتج cAMP.

يرتبط هذا المخيم بمجال ربط المستشعر الحيوي ، مما ينشط لوسيفيراز ، الذي يتفاعل مع الركيزة لإصدار الضوء.

قياس اللمعان في الوقت الفعلي. تشير الزيادة في اللمعان مع تركيزات أعلى من الرائحة إلى تنشيط OR بواسطة الرائحة.

قبل التحفيز ، راقب الخلايا المنقولة تحت مجهر تباين الطور لضمان التقاء مناسب من 50٪ إلى 80٪ لكل بئر قبل العودة إلى الحاضنة. بعد ذلك ، قم بإعداد وسط التحفيز عن طريق إضافة 10 ملليمولار HEPES و 5 ملليمولار جلوكوز إلى محلول الملح المتوازن من هانك. قم بإذابة 55 ميكرولترا من حصص كاشف ركيزة مقايسة AMP الدورية في الوقت الفعلي على الجليد.

قم بإعداد محلول توازن بنسبة 2٪ عن طريق خلط 55 ميكرولتر من كاشف الركيزة و 2,750 ميكرولتر من وسط التحفيز. بعد نشر طبقة سميكة من المناشف الورقية على المقعد ، اضغط برفق وبشكل متكرر على اللوحة رأسا على عقب على المناشف الورقية حتى تمتص المناشف الورقية وسط التعداد. اغسل الخلايا عن طريق سحب 50 ميكرولتر من وسط التحفيز لكل بئر.

اضغط برفق وبشكل متكرر على وسط التحفيز من اللوحة المكونة من 96 بئرا. ماصة 25 ميكرولتر من محلول التوازن بنسبة 2٪ في كل بئر وتحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين. قبل نهاية وقت الحضانة ، قم بتخفيف محاليل مخزون الرائحة المذابة لتركيز العمل في وسط التحفيز.

قبل إضافة الرائحة ، استخدم قارئ لوحة التلألؤ الكيميائي لقياس مستوى اللمعان القاعدي للوحة. قم بإزالة اللوحة بسرعة من قارئ اللوحة وأضف 25 ميكرولترا من تخفيفات الرائحة إلى كل بئر. بعد ذلك ، ابدأ على الفور في قياس التلألؤ المستمر لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة.