موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 2:58 دقيقة • July 8th, 2025
خذ الجهاز الهضمي الجنيني المعدل وراثيا في مرحلة النمو المطلوبة.
الجهازالعصبي المعوي الجهاز الهضمي يشمل الخلايا العصبية المعوية والخلايا العصبية اتروبين التي تعبر عن الكولين أسيتيل ترانسفيراز.
هذه الخلايا العصبية اتروبين تعبر أيضا عن بروتين الفلورسنت مدفوعة بمحفز أستيل ترانسفيراز الكولين.
احتضان المسالك بمنظف غير أيوني وبروتينات لاختراق الخلايا ومنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
استبدال الأجسام المضادة الأولية. احتضان الأجسام المضادة لربط البروتينات المستهدفة في الخلايا العصبية ، على التوالي.
قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة واغسلها بمحلول عازل.
احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور لربط الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتينات المستهدفة على وجه التحديد.
قم بإزالة الأجسام المضادة الزائدة وغسلها بمحلول عازل.
اغمر المسالك المسمى في وسائط التثبيت التي تحتوي على صبغة نووية لتلطيخ النوى. الآن ، قم بتركيب غطاء.
باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، تصور وتحليل توزيع الخلايا العصبية الكولينية في الجهاز الهضمي.
ضع المسالك الهضمية في أنبوب سعة 0.2 مليلتر يحتوي على محلول مانع ، يتكون من 1x PBS ، و 3٪ ألبومين مصل بقري ، و 0.1 Triton X-100 ، وصخور لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الانسداد، استنشق محلول الانسداد بماصة باستور ذات رؤوس دقيقة واستبدلها بالتخفيف الأمثل للأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحبس.
احتضن لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على المنصة الهزازة. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بشفط محلول الجسم المضاد واشطف المسالك الهضمية في PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ، ثم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز.
بعد الغسيل الأخير ، استبدل PBS بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المخففة في محلول مانع ، وضع الأنابيب على منصة الهزاز في الظلام لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة ، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
بعد غسل مسالك الجهاز الهضمي كما كان من قبل ، ضع بضع قطرات من وسائط التثبيت الفلورية باستخدام DAPI على شريحة زجاجية ، ثم اغمر جهاز GI في وسط التثبيت وأضف زجاج غطاء. أخيرا ، التقط صورا لكل فلوروفور باستخدام مجهر متحد البؤر ، ثم قم بإجراء تحليل الصور بمساعدة الكمبيوتر باستخدام البرامج المناسبة.