حقن ناقل فيروسي في مادة الفئران السوداء لنمذجة الأمراض التنكسية العصبية

قم بتأمين فأر مخدر في إطار تجسيمي.

تطهير فروة الرأس وعمل شق في خط الوسط في الجمجمة لكشف الجمجمة.

حدد بريجما ولاجدا ، وهما نقطتان مرجعيتان على الجمجمة ، لتحديد موقع الحقن.

تحضير حقنة حقن مجهرية تحتوي على معلق ناقل فيروسي.

يحمل الناقل الفيروسي جينات معدلة وراثيا يشفر ألفا سينوكلين ، وهو بروتين يخضع للطي الخاطئ والتجميع في الخلايا العصبية للمادة السوداء في الأمراض التنكسية العصبية.

ضع المحقنة في أداة التجسيم المتصلة بمضخة الحقن المجهري.

قم بإنشاء ثقب لدغ في موقع الحقن ، وتجنب إصابة الدماغ.

اخترق الجافية بإبرة ونظف أي دم بأنسجة معقمة.

أدخل إبرة الحقن المجهري من خلال فتحة الأزيز للوصول إلى المادة السوداء.

حقن المعلق الفيروسي ببطء ، مما يضمن التوزيع المتساوي.

توقف لفترة وجيزة لمنع التدفق العكسي ، ثم اسحب الإبرة ببطء.

خياطة الشق.

النموذج جاهز الآن لمزيد من التحليل.

ابدأ بتخدير أنثى فأر ويستار البالغة من العمر ثمانية أسابيع بشكل صحيح وفقا للبروتوكولات المعتمدة. تأكد من تحقيق خطة جراحية للتخدير عن طريق الضغط على كل مخلب وملاحظة عدم وجود منعكس الانسحاب. بعد ذلك ، استخدم جهاز زرع جهاز الإرسال والاستقبال الدقيق لوضع جهاز إرسال واستقبال دقيق على ظهر الفئران. تأكد من وضع جهاز الإرسال والاستقبال الدقيق بشكل صحيح ، وأنه يمكن الحصول على قراءة.

الآن قص الشعر على فروة رأس الفئران وتطبيق مخدر موضعي على فروة الرأس والأذنين. انقل الفئران إلى غطاء التدفق الصفحي ، وقم بتنفيذ بقية الإجراء باستخدام تقنية معقمة. ضع الجرذ في الإطار التجسيمي عن طريق تأمين قضبان الأذن ، متبوعا بشريط الفم والأنف. قم بتغطية جسم الجرذ ببطانية ورقية لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. ضع مادة تشحيم العين لمنع جفاف العينين.

بعد ذلك ، قم بتطهير فروة الرأس وفقا للإجراءات المعتمدة. يتم استخدام 1٪ يود في 70٪ من الأيزوبروبانول هنا. بعد عمل شق صغير في خط الوسط لفروة الرأس ، اكشط الأغشية الموجودة على الجمجمة برفق ، واشطفها بالمحلول الملحي. بعد ترك الجمجمة تجف ، تأكد من رؤية بريجما ولاجدا بوضوح.

الآن ، املأ حقنة حقن دقيقة سعة 10 ميكرولتر ، 30 ملم 20 ملم ب AAV المؤتلف ، وضعها على مضخة الحقن الدقيق الآلية المتصلة بأداة التجسيم.

بالنسبة لنقل محدد للخلايا العصبية الدوبامين للمادة السوداء ، فإن نواقل AAV المؤتلفة هي الخيار الأول بسبب عياراتها العالية وكفاءتها في تحويل الخلايا العصبية الدوبامينية.

اختبر التدفق عن طريق إطلاق قطرة من AAV. تخلص من أي AAV تم إطلاقه في منظف تنظيف متعدد التكافؤ. تحقق بصريا من تثبيت الرأس بشكل مستقيم في إطار الرأس. ثم تأكد من أن الجمجمة مسطحة عن طريق تحريك طرف الإبرة أولا إلى بريجما ، وقياس الارتفاع عند هذه المرحلة عن طريق خفض طرف الإبرة في الاتجاه الظهري البطني ، حتى تلامس الجمجمة. كرر الإجراء في لامدا.

بعد إعادة الإبرة إلى بريجما ، حرك الإبرة في الاتجاه الأمامي الخلفي والمتوسطة الجانبي إلى الإحداثيات التجسيمية للحقن المجهري. اكتب الإحداثيات. في موقع الحقن ، قم بقياس ارتفاع الجمجمة كما كان من قبل ، وتأكد من أنها لا تختلف أكثر من 0.3 ملليمتر عن ارتفاع البرجما.

ثم حفر بعناية ثقب 2 ملم في الجمجمة. بمجرد حفر الحفرة ، قم بقياس ارتفاع الجافية لتحديد المرجع الذي يتم من خلاله تطبيق الإحداثيات الظهرية البطنية. اخترق الجافية باستخدام إبرة قياس 26. امتصاص أي دم بأنسجة معقمة ، واستمر فقط بعد توقف كل النزيف.

الآن قم بخفض إبرة حقنة الحقن المجهري المحملة مسبقا ببطء في الدماغ إلى الإحداثيات البطنية الظهرية ، وتوقف مؤقتا لمدة دقيقة واحدة. ثم حقن ثلاثة ميكرولترات من AAV بمعدل 0.25 ميكرولتر في الدقيقة. بعد الحقن ، اترك الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق أخرى لمنع التدفق العكسي على طول مسار الإبرة قبل إزالتها ببطء.

بغرز فروة الرأس باستخدام البوليستر المضفر المطلي 3.0 ، وقم بتطهير الجلد باستخدام 1٪ من اليود في 70٪ من الأيزوبروبانول ، لفك شريط الأنف والفم ، ثم قضيبتي الأذن لإزالة برفق من الأداة التجسيمية. في هذا الوقت ، قم بإدارة التسكين ، وإذا لزم الأمر ، عامل عكس التخدير. ثم ضع الجرذ في قفص نظيف على لوح تسخين مضبوطة على 38 درجة مئوية وراقبه عن كثب حتى يستيقظ.