عزل مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة

ابدأ بعينة من أنسجة المخ البشري المجمدة بعد الوفاة من حالة مرض تنكسية عصبية مؤكدة.

استئصال المادة الرمادية الغنية بمجاميع البروتين غير القابلة للذوبان ، وهي السمة المميزة للمرض.

انقل الأنسجة إلى الخالط.

أضف عازلة تحتوي على مثبطات وتجانس لتحرير مكونات داخل الخلايا.

تمنع المثبطات إنزيمات البروتياز والفوسفاتيز ، مما يمنع تدهور البروتين.

انقل المتجانس إلى أنبوب وأضف عازلة المنظفات الأيونية. حضن.

المنظف على إذابة البروتينات المطوية أصلا ، بينما تظل مجاميع البروتين غير المطوية سليمة.

صوتية لإكمال التفكك الخلوي.

انقل المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي فائق وجهاز طرد مركزي بسرعة عالية.

تستقر الركام في الأسفل.

قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على البروتينات القابلة للذوبان في المنظفات.

اغسل الركام بمحلول منظف أيوني ، وجهاز طرد مركزي ، وقم بإزالة المادة الطافية.

أضف عازلة اليوريا لتشويه طبيعة مجاميع البروتين ، مما يجعلها قابلة للذوبان.

نقل مجاميع البروتين الذوبان إلى أنبوب وصوتنة لفترة وجيزة لضمان الذوبان الكامل.

الحصول على أنسجة المخ المجمدة بعد الوفاة من التحكم الصحي والمؤكدة مرضيا لمرض الزهايمر استخدم الملقط وشفرة الحلاقة لاستئصال ما يقرب من 250 ملليغرام من المادة الرمادية من كل عينة من الأنسجة. اسمح لجزء الدماغ بالذوبان لمدة دقيقة واحدة. الآن ، قم بتقطيع قطعة من الأنسجة إلى قطع مكعبة بحجم ملليمترين تقريبا أثناء ذوبانها. انقله إلى أنبوب مغالط مبرد مسبقا سعة ملليلترين على الثلج.

تذكر تجنب المادة البيضاء وأي أوعية دموية كبيرة.

اعمل بسرعة وضع المنديل على قوارب الوزن التي يمكن التخلص منها. احرص على منع ذوبان الأنسجة عن طريق وضع قارب الوزن مع أنسجة المخ بشكل متكرر في حاويات البوليسترين بها ثلج جاف. بعد تشريح ووزن جميع قطع الأنسجة المطلوبة ، قم بإزالة قارب الوزن الذي يحتوي على قطعة من الأنسجة من الجليد الجاف.

بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من المحلول البارد منخفض الملح مع كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز لكل جرام من الأنسجة ، وقم بتجانسها على الجليد باستخدام ما يقرب من 10 ضربات من المدقة عالية الخلوص A و 15 ضربة من المدقة منخفضة الخلوص B. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور زجاجية مقاس تسعة بوصات لنقل كل متجانس إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة ملليلتر. قم بتقسيم المتجانس المتبقي إلى أنابيب إضافية مسماة 1.5 مليلتر بطريقة مماثلة للتخزين عند -80 درجة مئوية.

للمضي قدما في التجزئة ، أضف 100 ميكرولتر من خمسة كلوريد صوديوم مولي و 100 ميكرولتر من 10٪ ساركوسيل لكل حصة 0.8 ملليمتر. تخلط جيدا عن طريق الانعكاس ، ثم تحتضن على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم مكبر صوتي مزود بمسبار ذو طرف صغير لتقديم ثلاث نبضات مدتها 5 ثوان بسعة 30٪.

بعد استخدام طريقة حمض البيسنكونينيك لتحديد تركيزات البروتين في المتجانسات ، أضف عازلة سارك المثلجة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز لكل عينة إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ملليغرام لكل ملليمتر. بعد ذلك ، قم بنقل 500 ميكرولتر من كل عينة إلى 500 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي الفائق من البولي كربونات.

قم بتحميل الأنابيب في دوار مبرد مسبقا ، وجهاز طرد مركزي فائق عند 180،000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، انقل المواد الطافية القابلة للذوبان في ساركوسيل S1 إلى أنابيب 1.5 مليلتر وتخزينها عند -80 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول السارك إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة التي تحتوي على أجزاء P1 غير القابلة للذوبان من المنظفات واستخدم طرف الماصة لإخراج الكريات من قاع أنابيب الطرد المركزي الفائق.

بعد ذلك ، قم بنقل كريات P1 المعلقة إلى أنابيب طرد مركزي فائقة جديدة سعة 500 ميكرولتر ، وتوازن زوج ، وأجهزة طرد مركزي عند 180,000 مرة جم لمدة 30 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية S2 ، ثم أضف 50 إلى 75 ميكرولترا من محلول اليوريا مع كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز إلى حبيبات ساركوسيل غير القابلة للذوبان واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإذابة حبيبات P2.

بعد الحضانة ، انقل كريات P2 المعلقة إلى أنابيب مسمى 0.5 ملم وقم بإذابة الكريات بالكامل باستخدام صوتنة قصيرة مدتها 1 ثانية بسعة 20٪. تحديد تركيزات البروتين للأجزاء غير القابلة للذوبان من sarkosyl و sarkosyl باستخدام طريقة فحص BCA.