موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 3:13 دقيقة • July 8th, 2025
خذ مزارع الجزر الصغيرة للخلايا العصبية الدوبامين الأولية للفأر الجنيني في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط.
تتم معالجة هذه الخلايا العصبية مسبقا بألياف مسبقة التكوين (PFFs) - وهي أشكال غير مطوية ومجمعة من بروتين ألفا سينوكلين.
تعمل PFFs كبذور ، مما يؤدي إلى مزيد من الخلل في الطي وقلة ألفا سينوكلين الداخلي ، وتشكيل ألياف ألفا سينوكلين الفسفرية. تشكل هذه الألياف في النهاية أجسام ليوي.
استبدل الوسائط بمثبت للحفاظ على التشكل الخلوي.
اغسل الخلايا بالعازلة.
أدخل عازلة تحتوي على منظف لاختراق أغشية الخلايا.
أضف محلول حجب لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد.
أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف ألفا سينوكلين الفسفوري وبروتين مرجعي يتم التعبير عنه في كل مكان في الخلايا العصبية الدوبامينية.
يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
إدخال الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية المعنية.
يغسل مرة أخرى لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
أضف صبغة ملزمة للحمض النووي لتلطيخ النوى.
باستخدام ماسح ضوئي للوحة مضان ، حدد كمية الخلايا العصبية الدوبامين التي تحتوي على مجاميع ألفا سينوكلين السيتوبلازمية.
أضف 3.75 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الألياف المشكلة مسبقا إلى كل بئر تجريبي ، و 3.75 ميكرولتر من PBS لكل بئر تحكم.
عند العمل مع PFFs ، كن حذرا بشأن تلوث البروتين غير المرغوب فيه وبعد ذلك ، قم بتنظيف الغطاء وجميع الأدوات المرتبطة ب PFF باستخدام 1٪ SDS و 70٪ إيثانول.
عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، بعد تلطيخ علامات الاهتمام ، قم بتحميل لوحة ثقافة البئر 96 على ماسح ضوئي للوحة عالية المحتوى ، مزود بهدف 10x. اضبط الإعدادات وفقا لمواصفات لوحة البئر 96 ، مثل نوع اللوحة والشركة المصنعة والحجم والمسافة بين الآبار ونوع وحجم الوسط.
حدد منطقة التصوير للآبار لتغطية جميع الخلايا في كل جزيرة صغيرة ، واستخدم بئرا واحدا لضبط التركيز البؤري التلقائي على تعبير DAPI. قم بمعايرة وقت الاستحواذ لكل قناة فلورية ، بناء على شدة التلوين في آبار التحكم ، واضبط المعلمات بحيث يتم تمييز خلايا الدوبامين في آبار التحكم المعالجة بالألياف مسبقة التشكيل ، والتي تحتوي على مجاميع الفوسفوسرين 129 ألفا سينوكلين داخل سوما الخلية ، مما يسمح بقياس كمي لا لبس فيه للخلايا الإيجابية والسالبة للفوسفوسيرين ألفا سينوكلين.
بعد ذلك ، قم بتصوير جميع الآبار المحددة في وقت واحد في جميع القنوات ، باستخدام نفس المعلمات تماما لكل بئر.