دراسة تراكم ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية للفأر

خذ مزارع الجزر الصغيرة للخلايا العصبية الدوبامين الأولية للفأر الجنيني في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط.

تتم معالجة هذه الخلايا العصبية مسبقا بألياف مسبقة التكوين (PFFs) - وهي أشكال غير مطوية ومجمعة من بروتين ألفا سينوكلين.

تعمل PFFs كبذور ، مما يؤدي إلى مزيد من الخلل في الطي وقلة ألفا سينوكلين الداخلي ، وتشكيل ألياف ألفا سينوكلين الفسفرية. تشكل هذه الألياف في النهاية أجسام ليوي.

استبدل الوسائط بمثبت للحفاظ على التشكل الخلوي.

اغسل الخلايا بالعازلة.

أدخل عازلة تحتوي على منظف لاختراق أغشية الخلايا.

أضف محلول حجب لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف ألفا سينوكلين الفسفوري وبروتين مرجعي يتم التعبير عنه في كل مكان في الخلايا العصبية الدوبامينية.

يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

إدخال الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية المعنية.

يغسل مرة أخرى لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أضف صبغة ملزمة للحمض النووي لتلطيخ النوى.

باستخدام ماسح ضوئي للوحة مضان ، حدد كمية الخلايا العصبية الدوبامين التي تحتوي على مجاميع ألفا سينوكلين السيتوبلازمية.

أضف 3.75 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الألياف المشكلة مسبقا إلى كل بئر تجريبي ، و 3.75 ميكرولتر من PBS لكل بئر تحكم.

عند العمل مع PFFs ، كن