اختبار لوسيفيراز لقياس نشاط γ السيكريتاز في الخلايا البشرية

ابدأ بالخلايا البشرية المعدلة وراثيا في وسط النمو.

تحتوي هذه الخلايا على نظام محفز للتتراسيكلين يمتلك بروتين سلائف الأميلويد أو جين APP وجين لوسيفيراز.

استبدل بوسط يحتوي على التتراسيكلين واحتضانه.

يرتبط التتراسيكلين ببروتين المنشط ، الذي يرتبط بمروج APP.

هذا يحفز التعبير الجيني وينتج البروتينات السليفة التي تتمركز في غشاء الخلية.

يشق إنزيم β-Secretase APP ، مما ينتج عنه جزء يظل متصلا بغشاء الخلية.

يشق γ-secretase هذا الجزء ، وينتج ببتيدات β الأميلويد ويطلق مكونا منشطا.

يدخل هذا المنشط إلى النواة ، ويرتبط بمحفز لوسيفيراز ، ويحث على التعبير الجيني ، وينتج إنزيمات لوسيفيراز.

استبدل الوسط بكاشف فحص يحتوي على ركيزة لوسيفيراز. تنتشر الركيزة في الخلايا وتتفاعل مع لوسيفيراز ، مما ينتج عنه تلألؤ بيولوجي.

استخدم قارئ صفيحة دقيقة لقياس شدة الضوء ، والتي تعكس بشكل مباشر نشاط γ سيكريتيز ، وهو إنزيم حاسم في الحالات المرضية العصبية.

عد خلايا NG أو CG باستخدام مقياس الدم. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في 20,000 خلية لكل بئر على صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا بحجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر في وسط النمو. انقل الصفائح الدقيقة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من وسط النمو من كل بئر.

أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من وسط النمو يحتوي على 2 ميكروغرام لكل مليلتر من التتراسيكلين إما مع 0.2٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو اثنين من ميكرومولار CL 387 ، 785 ، أو اثنين من micromolar DAPT أو مثبطات ErbB1 / ErbB2 الأخرى ذات الصلة. احتضان الخلايا المعالجة في صفائح دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة 150 ميكرولتر لكل بئر من وسط النمو من الصفائح الدقيقة.

ثم أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من كاشف فحص لوسيفيراز. بعد ذلك ، انقل الصفائح الدقيقة إلى قارئ اللفائح الدقيقة واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. حدد التلألؤ المنبعث من لوسيفيراز اليراع باستخدام برنامج محدد مسبقا مخزن في قارئ اللفائح الدقيقة للتلألؤ.