الكيمياء المناعية لتحديد منطقة الموضع الخشبي في أقسام دماغ الفئران

تحتوي مناطق الموضع اللولبي, تقع ثنائيا في جذع دماغ الفأر, على الخلايا العصبية المنتجة للنورادرينالين وتنظم مناطق مختلفة في الدماغ.

للكشف عن مناطق الموضع المزمن هذه ، ابدأ بشريحة زجاجية تحمل أقسام جذع دماغ الفأر الثابتة والمحفوظة بالتبريد.

اغسل الشريحة بمخزن مؤقت لإزالة الآثار التثبيتية.

أضف عازلة تحتوي على منظف واحتضانها لاختراق الأغشية ، ثم اغسلها.

إدخال الأجسام المضادة الأولية الخاصة بإنزيم الدوبامين β-هيدروكسيلاز ، الذي يحول الدوبامين إلى نورادرينالين ، وهو ناقل عصبي.

احتضان للسماح للأجسام المضادة بالتفاعل مع الدوبامين β-هيدروكسيلاز.

يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

ثم أضف الأجسام المضادة الثانوية الخضراء المقترنة بالفلوروفور واحتضانها في الظلام.

ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالأجسام المضادة الأولية ثم تغسل.

أضف وسيط التثبيت إلى أقسام الدماغ ، ثم قم بتغطيته وجففه.

راقب الشرائح تحت المجهر الفلوري.

يشير التألق الأخضر الذي يمثل الخلايا العصبية المنتجة للنورادرينالين المسمى في أقسام الدماغ إلى وجود مناطق الموضع اللولبي.

في اليوم الأول ، اغسل شرائح الدماغ في طبق 24 بئرا 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في PBS. ثم أضف 0.5٪ PBS مع المنظف ، وقم بنفاذها عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها بنسبة 0.5٪ PBSD. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد الأساسي عند تخفيف من 1 إلى 500 في 0.5٪ PBSD ، واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة.

في اليوم الثالث ، اغسل الشرائح 3 مرات لمدة 10 دقائق مع 0.5٪ PBSD. ثم أضف الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف من 1 إلى 1,000 في 0.5٪ PBSD. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة.

بعد الحضانة ، اغسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 0.5٪ PBSD ، ثم لمدة 5 دقائق في PBS. قم بتغطية الأقسام باستخدام وسيط تثبيت ثابت بدون DAPI. غطيها بغطاء زجاجي وجففيها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم مجهرا متحد البؤر مع إعدادات لاكتشاف الإشارة من الطول الموجي الفلوري المناسب ، لتصوير شرائح الدماغ.