موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 6:31 دقيقة • July 8th, 2025
حصاد الأنسجة البارزة العقدية الإنسية ، التي تحتوي على أسلاف الخلايا العصبية القشرية ، من أجنة الفئران المعدلة وراثيا.
أضف بوليمر كاتيوني وفصل الأنسجة إلى معلق أحادي الخلية.
أضف نواقل الفيروسات العسقرية التي تحمل مراسل GFP المعتمد على إعادة تركيب Cre محاط بمواقع lox. حضن.
يعملالبوليمر على تحييد شحنات غشاء الخلية الفيروسية والمضيفة ، مما يتيح الاندماج الفيروسي وإطلاق الحمض النووي الريبي.
يتم نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي عكسيا ودمجها في جينوم المضيف.
جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية. امتصاص الوسائط الزائدة.
انقل الخلايا إلى سطح كاره للماء وقم بتحميلها في جهاز الحقن.
حقن الخلايا في قشرة جرو الفأر المخدر.
اسمح للجرو بالتعافي والنمو.
تتمايز الأسلاف المزروعة إلى خلايا عصبية داخلية ناضجة في القشرة.
تشارك مجموعة فرعية من هذه الخلايا العصبية الداخلية في التعبير عن Cre recombinase و RFP.
في هذه الخلايا العصبية الداخلية ، يقوم Cre باستئصال مواقع lox ، مما يقلب جين GFP ويتيح التعبير عنه.
تصور التعبير المشترك RFP و GFP لتحديد الخلايا العصبية الداخلية التي تعبر عن Cre.
بعد تحضير فيروس العدسات وتشريح MGE وفقا للإرشادات الواردة في البروتوكول المكتوب ، اجمع نصفي الكرة الأرضية من MGE وضع الأنسجة في أنبوبين لتجميع سعة 1.5 مليلتر يحتويان على 500 ميكرولتر من DMEM مع FBS بنسبة 10٪.
احتفظ بالعينات على الثلج حتى يتم جمع كل الأنسجة. ثم انقل الأنابيب إلى غطاء محرك معتمد من BSL-2. استنشق الوسائط بعناية دون إزعاج أنسجة MGE المستقرة في الجزء السفلي من الأنبوب.
ثم أضف حوالي 500 ميكرولتر من DMEM المسخن مسبقا مع وسائط FBS بنسبة 10٪. أضف البوليبرين إلى التركيز النهائي البالغ 8 ميكروغرام لكل مليلتر ، وقم بالمعايرة من خلال طرف ماصة P1000 حتى يتم تحقيق تعليق أحادي الخلية. ثم أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من فيروس العدسات المركز إلى كل أنبوب.
بعد ذلك ، أغلق كل أنبوب بإحكام ، واقلبها للخلط ، ثم ضع جميع الأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا بفيروس العدسات لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من ساعة ، حيث أدت الأوقات الأطول إلى انخفاض قابلية الخلايا. اقلب الأنابيب كل 10 دقائق.
بعد الحضانة ، قم بإزالة الأنابيب من الحاضنة ، وجهاز الطرد المركزي عند 700 مرة جم عند 4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق لحبيبات الخلايا. في غطاء محرك BSL-2 ، قم بإزالة المادة الطافية وتخلص منها في مبيض بنسبة 10٪. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من DMEM مع FBS بنسبة 10٪ ، وقم بمعايرة الحبيبات مرتين إلى ثلاث مرات لغسلها.
بعد الطرد المركزي كما كان من قبل ، كرر خطوة الغسيل هذه مرتين إلى ثلاث مرات أخرى لإزالة الفيروس الزائد. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط ، وضع كل أنبوب على الثلج.
بسبب الوسائط المتبقية على جانبي الأنبوب ، سينتهي الأمر بحوالي 2 إلى 3 ميكرولتر من الوسائط بتغطية حبيبات الخلية ، بحلول الوقت الذي تبدأ فيه عملية الزرع. مع التأكد من استخدام تقنية التعقيم طوال الوقت، اسحب الزيت المعدني في حقنة سعة 1 ملليلتر، ثم باستخدام إبرة قياس 30.5، املأ الماصة الزجاجية بالكامل بالزيت المعدني.
بعد ذلك ، قم بتوصيل الماصة الزجاجية بالجهاز التجسيمي وقم بتحميلها على المكبس. باستخدام أحد المساعدين الذين يستخدمون المحرك الهيدروليكي ، حرك المكبس في منتصف الطريق تقريبا إلى الماصة الزجاجية ، وقم بإزالة الزيت المعدني الذي ينسكب بمنشفة ورقية نظيفة.
بعد ذلك ، قم بلف زاوية منشفة ورقية معقمة في نقطة دقيقة ، واستخدمها لإزالة الوسائط الزائدة بدقة فوق حبيبات خلية MGE. سيؤدي ذلك إلى تركيز كثافة الخلية بحيث يمكن تحقيق أحجام حقن أصغر.
بعد ذلك ، استخدم ماصة P2 لسحب حبيبات الخلية ببطء والمعايرة مرة إلى مرتين قبل الاستغناء عنها على سطح كاره للماء. يجب أن يكون الحجم أقل بقليل من 1 ميكرولتر.
حرك طرف الإبرة إلى تعليق الخلية ، وباستخدام المحرك الهيدروليكي ، اسحب تعليق الخلية في الماصة. بعد تخدير الجرو عن طريق انخفاض حرارة الجسم ، تحقق من فعالية التخدير عن طريق الضغط على الجلد بين أصابع القدم بالملقط. لا ينبغي رؤية أي رد فعل.
بعد ذلك ، ضع الجرو على قالب موجود أسفل جهاز الحقن ، واجعل الجلد مشدودا عن طريق سحب الجلد على الرأس للخلف ثم تثبيته بشريط مختبر قياسي. العمل بسرعة ، وقم بمعالجة الذراع التجسيمية لوضع طرف الماصة الزجاجية على رأس الجرو ، بشكل عمودي على سطح الرأس.
عندما تكون الماصة على اتصال بالرأس، اعتبر هذا صفرا. بعد ذلك ، ادفع الماصة عبر سطح الجلد والجمجمة إلى القشرة. بعد ذلك، أدخل الماصة وسحبها مرتين قبل التوقف.
لاستهداف الخلايا في القشرة المخية الحديثة ، يتم إجراء الحقن عندما تكون الماصة الدقيقة على عمق 0.1 ملليمتر. بمجرد أن تصبح الإبرة في موضعها ، قم بتدوير الجهاز الهيدروليكي لدفع المكبس إلى الماصة الزجاجية ، وحقن 50 إلى 70 نانولتر لكل موقع.
كرر هذا الإجراء في ثلاثة إلى ستة مواقع مختلفة على مستويات ذيلية منقارية مختلفة إذا كانت هناك حاجة إلى توزيع واسع للخلايا المحولة في جميع أنحاء القشرة المخية الحديثة. عند اكتمال الحقن ، قم بإزالة الجرو من المسرح ووضع علامة عليه وفقا للإجراءات المعتمدة.
بمجرد أن يتعافى الجرو ويصبح قادرا على التحرك بمفرده ، أعده مع الأنثى المرضعة وبقية القمامة. افحص الجراء بعد العملية وفي اليوم التالي للتأكد من عدم وجود علامات على تدهور الصحة.