دراسة انتقال الخلايا الليمفاوية عبر طبقة أحادية للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة

خذ صفيحة دقيقة مع إدخالات شفافة الوصيف المغلفة ببروتينات ECM لتعزيز التصاق الخلايا.

أضف الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري ، أو HBMECs ، إلى الإدخالات ووسط النمو إلى المقصورات السفلية.

احتضان ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق والنمو لتصبح طبقة أحادية. تعبر هذه الخلايا عن تقاطعات ضيقة ، تحاكي بطانة الحاجز الدموي الدماغي التي تحد من مرور الخلايا والجزيئات.

قم بإزالة الوسيط. أضف خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، أو PBMCs ، إلى الإدخالات ووسط مزرعة إلى المقصورات السفلية.

احتضان ، مما يسمح للخلايا الليمفاوية PBMC بالتفاعل مع الخلايا البطانية ثم المرور بينها ، وهي عملية تسمى التحويل.

اشطف الجزء السفلي من الملحق ، واجمع الخلايا المنقولة الملتصقة في المقصورات السفلية.

أدخل الميكروبيدات الفلورية كمرجع لقياس كمية الخلية.

انقل المعلق إلى أنبوب ، وجهاز طرد مركزي ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقه في كوكتيل الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور لتسمية الخلايا الليمفاوية.

الخلايا الليمفاوية المنقولة جاهزة للقياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لتحضير إدخالات ثقافة الخلايا لمقايسة التحول ، قم أولا بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الفبرونيكتين إلى كل ملحق وإلى بئر واحد من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. بعد ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية ، استبدل محلول الفبرونيكتين ب 100 ميكرولتر من HBMEC ، وأضف 600 ميكرولتر من وسط ECM-b الطازج إلى الأجزاء السفلية من إدخالات زراعة الخلايا.

ثم أعد الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. أعد تعليق خلية الدم المحيطية أحادية النواة ، أو عينة PBMC إلى 5 أضعاف 10 إلى 6 خلايا لكل تركيز مليلتر في وسط RPMI المكمل ب B27. بعد ذلك ، قم بشفط الوسط من المقصورات السفلية والعلوية للعدد المناسب من إدخالات ثقافة الخلايا التي تحتوي على طبقات أحادية HBMEC المتقاربة ، وأضف 100 ميكرولتر من PBMC لكل متبرع إلى إدخالات زراعة الخلايا ، وإلى بئر واحد من لوحة 24 بئرا لكل عنصر تحكم في المختبر.

أضف 600 ميكرولتر من RPMI بالإضافة إلى B27 إلى المقصورات السفلية لإدخالات زراعة الخلايا و 500 ميكرولتر إلى آبار التحكم في المختبر ، وأعد الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ست ساعات. في نهاية الحضانة ، استخدم الملقط لإزالة إدخالات ثقافة الخلايا ، واشطف القيعان بعناية ب 400 ميكرولتر من PBS دون لمس الأغشية.

بعد ذلك ، قم بخلط 20 ميكرولترا من الغلاف الفلوري لعدد التدفق جيدا مع الخلايا الموجودة في آبار التحكم التجريبية وفي المختبر ، ونقل 1 مليلتر من معلقات PBMC الناتجة إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المناسبة. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم ذات الأهمية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي لكل عينة. بعد 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، اغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي الطازج وأعد تعليق الكريات في الحجم المناسب من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي للتحليل.