وضع العلامات على الخلايا العصبية الداخلية المملوءة بالسيتين الحيوي في شرائح الحصين الفئران للتصور

خذ شرائح الحصين الثابتة والمتنفذة للفئران التي تحتوي على الخلايا العصبية الداخلية المملوءة بالسيتين الحيوي مع بيروكسيداز داخلي

معطل

أضف مجمعات أفيدين البيوتين (ABC) التي تحتوي على بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) واحتضانها ، مما يسمح لأفيدين بالارتباط بالسيتين الحيوي.

اغسل ABC غير المنضم.

أضف مزيجا من الركيزة الملونة ومحسن المعدن ، ثم احتضن.

أدخل بيروكسيد الهيدروجين لتنشيط HRP ، الذي يؤكسد الركيزة لتكوين راسب مظلم ، بينما يحسن المحسن التباين.

انقل الشرائح إلى ورق الترشيح وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد. عالج برباع أكسيد الأوزميوم لتعزيز التباين.

ضع الشرائح على شريحة وقم بتثبيتها. قم بتجفيفها باستخدام زيادة تركيزات الإيثانول.

اغسل الشرائح بالإيثانول المطلق وأكسيد البروبيلين.

أضف الراتنج للتسلل إلى الأنسجة.

ضع الشرائح في لوشب وسخنها لبلمرة الراتنج. انقل الشرائح إلى شريحة ، ضع غطاء ، وقم بتجميد الراتنج.

باستخدام الفحص المجهري الضوئي ، تصور الخلايا العصبية الداخلية المملوءة بالسيتين الحيوي الملطخة بشكل داكن.

ضع الأقسام في قارورة زجاجية نظيفة تحتوي على PBS. قم بإجراء تفاعل أفيدين HRP عن طريق احتضان الأقسام أولا في مركب أفيدين بيوتين ، أو ABC ، لمدة ساعتين على الأقل لتضخيم منتج تفاعل HRP.

بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام PBS 3 مرات لمدة 10 دقائق ، ثم باستخدام مخزن Tris المؤقت مرتين لمدة 10 دقائق. بعد إزالة آخر غسول عازل للتتبع ، أضف بسرعة قطرة واحدة من محلول كلوريد النيكل بنسبة 8٪ إلى محلول ديامينوبينزيدين ، أو محلول DAB. ثم قم بإدخال المحلول وإخراجه للخلط.

وأضف بسرعة 1 مليلتر من هذا المحلول على الأقسام. احتضان الأقسام في هذا المحلول لمدة 15 دقيقة. ثم أضف 10 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 1٪ إلى محلول DAB. اسمح للتفاعل بالاستمرار في الظلام تحت الإثارة المستمرة لمدة 1 إلى 2 دقيقة ، حتى يتم تصنيف الخلايا.

في غطاء الدخان ، ضع دائرة صغيرة من ورق الترشيح في طبق بتري وقم بترطيبها باستخدام PB. ارفع الأقسام واحدة تلو الأخرى من القارورة الزجاجية باستخدام فرشاة الرسم ، وضعها بعناية على الورق. قم بتغطية الأقسام بدائرة أخرى مبللة من ورق الترشيح. وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق لمس المناديل الورقية برفق على السطح.

ضع 8 أو 9 قطرات من رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في PB على الورق العلوي. غطي الطبق واحتفظي به في غطاء الدخان لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من ساعة واحدة. بعد شطف الأقسام وتركيبها وتغطية الأقسام ، قم بتجفيف سلسلة من محاليل الكحول بنسبة 50٪ و 70٪ و 95٪ و 100٪.

بعد خطوة التجفيف ، انقل الأقسام إلى قارورة زجاجية تحتوي على 100٪ من الإيثانول على شاكر لمدة 5 دقائق تقريبا. استبدل محلول الكحول بأكسيد البروبيلين ، واغسله ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الأخير ، احتفظ بحوالي 2 مل من أكسيد البروبيلين في القارورة ، وأضف الراتنج بنسبة واحد إلى واحد.

تأكد من إذابة الراتنج ، واحتفظ بالأقسام تحت التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، استخدم عصا خشبية لوضع كل قسم في لوح من الألومنيوم يحتوي على راتنجات الايبوكسي واحتضانه طوال الليل. في اليوم التالي ، ضع اللوح الخشبي على طبق ساخن لمدة 10 دقائق تقريبا.

ثم التقط كل قسم بعصا خشبية وضعه على شريحة نظيفة. بمجرد نقل جميع الأقسام إلى الشريحة ، اعرض الشريحة تحت مجهر تشريح للتحقق من اتجاه الشرائح ووضع غطاء فوق الأقسام. يعالج في الفرن لمدة 48 ساعة عند 56 درجة مئوية.