التهجين في الموقع باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات لدراسة تعبير الحمض النووي الريبي في أقسام دماغ الفئران

خذ أقسام دماغية ثابتة من فأر مصاب بمتلازمة السيروتونين ، مما يؤدي إلى تغيير تخليق الحمض النووي الريبي لمستقبلات السيروتونين في الخلايا العصبية.

تجفيف الأنسجة باستخدام الكحول. استخدم محلول المعالجة المسبقة لتعطيل إنزيمات التحلل المائي الذاتية ، مما يمنع تفاعلها مع كواشف الكشف.

عالج بمخزن مؤقت مغلي لكسر الروابط المتشابكة الناجمة عن التثبيت ، مما يؤدي إلى تعريض الحمض النووي الريبي المستهدف.

قم بتجفيف الأنسجة ، وارسم حاجزا كارها للماء ، واحتضانه بمحلول لاختراق الأغشية الخلوية.

أضف مجسات قليل النوكليوتيدات واحتضانها ، مما يسمح للمجسات بالتهجين مع الحمض النووي الريبي المستهدف.

اغسل لإزالة المجسات غير المرتبطة ، ثم احتضانها باستخدام كواشف التضخيم التي تحتوي على مكبر للصوت ، ومكبر للصوت ، ومجسات ملصقات مترافقة بالإنزيم ترتبط بمجسات قليل النوكليوتيدات.

احتضان مع ركائز كروموجينيك يتم تحللها بواسطة المجسات المترافقة بالإنزيم ، مما ينتج عنه لون مرئي.

عالج بالزيلين لزيادة شفافية الأنسجة ، وإضافة وسيط تثبيت ، وتطبيق غطاء.

تحت المجهر ، تساعد البقع الملونة في الأنسجة في تحديد تعبير الحمض النووي الريبي المستهدف.

في هذا الإجراء ، للجفاف ، خذ أربع شرائح لصناديق شرائح المجهر المخزنة في الفريزر سالب 80 درجة مئوية. قم بتعيين الأقسام لاختبارات جينات ppiB و dapB و ht2a. ضع علامة عليها وقم بتسميتها بقلم حبر جاف.

بعد ذلك ، اغمر الشرائح في كحول 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم جفف الشرائح لمدة خمس دقائق في غطاء الدخان. للمعالجة المسبقة ، قم بتعبئة 20 ميكرولترا من المعالجة المسبقة كاشف واحد لكل قسم.

ضع الشرائح على سكة رف في صينية ترطيب. رج صينية الترطيب برفق على شاكر أفقي بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين. اغمر الشرائح في دورق سعة 1,000 ملليلتر يحتوي على 450 مل من كاشف المعالجة المسبقة 2.

بعد ذلك ، قم بغلي الشرائح لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية لاستعادة بنية الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين في كل مرة. ضع الشرائح في كحول 100٪ لمدة خمس دقائق.

ثم جفف الشرائح لمدة خمس دقائق في غطاء الدخان. استخدم قلما كارها للماء لرسم دائرة حول المنطقة المحددة في قسم الأنسجة. بعد ذلك ، قم بتعبئة 10 ميكرولتر من كاشف المعالجة المسبقة إلى كل منطقة محددة لزيادة اختراق المسبار ، وقم بتغطية صينية الرطوبة بغطاء.

بعد ذلك ، ضع الصينية في فرن التهجين المجهز بشاكر أفقي. اضبطي درجة حرارة الفرن على 40 درجة مئوية ورجي الصينية برفق لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين في كل مرة.

في هذه الخطوة، قم بعمل ماصة 10 ميكرولتر من مسبار ppiB أو dapB أو htr2a في المناطق المحددة. بعد ذلك ، قم بتغطية صينية الرطوبة بغطاء لمنع تبخر الكاشف. رج الشرائح برفق على الخلاط الأفقي بسرعة منخفضة أثناء احتضانها على حرارة 40 درجة مئوية في الفرن لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم 1 في كل منطقة محددة. رج العبوة واحتضان الشرائح على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة.

ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم 2 في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة.

ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم 3 في كل منطقة محددة. رج العبوة واحتضان الشرائح على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين.

ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم 4 في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين.

ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم 5 في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين.

ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم 6 في كل منطقة محددة. رج العبوة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم اغسل الشرائح مرة أخرى مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة.

الآن ، قم بتقطيع 10 ميكرولتر من الكاشف الأحمر إلى كل منطقة محددة. ضع الشرائح في درج الرطوبة على الخلاط الأفقي في درجة حرارة الغرفة ، ورجها برفق على سرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة 10 دقائق في كل مرة.

جفف الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الشرائح في الزيلين في غطاء الدخان لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتعبئة 20 ميكرولترا من وسائط التثبيت القائمة على الزيلين على كل منطقة محددة وقم بتغطيتها بغطاء للغطاء.