تلطيخ التألق المناعي لأدمغة ذبابة الفاكهة للتصوير أحادي الخلية للخلايا الدبقية

ابدأ بأدمغة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا ، والتي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا الدبقية التي تؤوي نظام إعادة تركيب خاص بالخلية.

إنه يقود التعبير عن بروتين سطح الخلية المدمجة في حواتم مستضدية مختلفة على نفس النوع من الخلايا.

عالج الأنسجة بمثبت لربط البروتينات والحفاظ على بنية الأنسجة.

يغسل لإزالة المثبت الزائد.

أضف البروتينات الحاجزة لإخفاء مواقع الربط غير المحددة لتقليل تلطيخ الخلفية.

احتضان الأنسجة بكوكتيل الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط بالحواتم المختلفة المعبر عنها في الخلايا الدبقية.

يغسل لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المقيدة.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

يغسل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.

قم بتركيب الدماغ داخل فاصل التصوير وضع غطاء للفاء. يخلق الفاصل غرفة للأنسجة ، ويحافظ على هيكلها ثلاثي الأبعاد.

تسمح الخلايا المختلفة من نفس النوع الدبقي المسمى بأجسام مضادة مختلفة مترافقة بالفلوروفور بفهم تفاعلات الخلية الخلية.

انقل الأدمغة المعزولة باستخدام طرف ماصة P10 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر بمحلول تثبيتي. لا تتعامل أبدا مع الأدمغة باستخدام الملقط. احتضان الأنسجة المحمية من الضوء. تجنب شفط الأدمغة أثناء نقل المحلول.

لإزالة المثبت ، استخدم ثلاث غسلات أو أكثر لمدة 15 دقيقة بمحلول الغسيل. بعد ذلك ، قم بسد الأنسجة بمحلول مانع لمدة 30 دقيقة أو أكثر. بعد ذلك ، استبدل محلول الحجب بالأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الغسيل ، واحتضان الأدمغة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

لإزالة الأجسام المضادة الأولية ، استخدم ثلاث غسلات لمدة 1 ساعة في محلول الغسيل. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور الثانوية في محلول الغسيل ، واحتضان الدماغ طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، أو لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. لغسل الأجسام المضادة غير المرتبطة تماما ، استخدم ثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في محلول الغسيل ، متبوعة بغسل أطول باستخدام PBS.

ثم قم بتركيب العقول. قم بإعداد غطاءين باستخدام فاصل التصوير. في الفاصل ، وعلى الغطاء الإضافي ، ضع 10 ميكرولتر من وسط التثبيت باستخدام عامل مضاد للبهتان. بعد ذلك ، باستخدام ماصة P10 ، انقل الأدمغة إلى الغطاء ، وقم بإيداعها بجوار الوسط مع بعض PBS. لا تدع الأنسجة تجف.

الآن ، انقل الأدمغة بعناية إلى وسط التركيب ، باستخدام الماصة. وأخيرا ، انقلها إلى الوسط الموجود في الفاصل ورتبها بالملقط. ثم قم بإزالة البطانة اللاصقة على الفواصل وقم بإرفاق غطاء. قم بتأمين الغطاء بقليل من الضغط باستخدام الملقط واستمر على الفور في التصوير.