تشابك البروتينات السطحية العصبية في دماغ الفأر باستخدام مقايسة التشابك الكيميائي

ابدأ بدماغ فأر معزول في عازل مثلج.

انقل الدماغ إلى مصفوفة دماغية ، بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى.

أدخل شفرات الحلاقة لقطع الجزء الأمامي من الدماغ بشكل متسلسل.

ارفع الشرائح عن طريق تثبيت الشفرات معا ، مع ترك الجزء الخلفي خلفك. افصل شفرات الحلاقة وضعها على سطح مبرد بحيث تكون شرائح الدماغ متجهة لأعلى.

حدد الشريحة المطلوبة واستخرج منطقة الاهتمام.

قسم الأنسجة وفرمها.

نقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب يحتوي على السائل النخاعي المكمل بالمادة الكيميائية BS3.

اقلب الأنبوب واخلطه لتقسيم الأنسجة إلى قطع أصغر ، ثم احتضانه بالدوران.

BS3 ، وهي مادة كيميائية غير منفذة لغشاء الخلية ، تربط البروتينات السطحية العصبية مثل مستقبلات GABA بينما تظل مستقبلات GABA الداخلية دون تغيير.

أضف الجلايسين لإخماد تفاعل التشابك.

العينة جاهزة لتقييم مستويات مستقبلات GABA السطحية.

للبدء ، قم بإزالة الدماغ بسرعة من جمجمة الفأر الأسود C57 6J الذي تم قتله رحيم. اغمرها في طبق بتري يحتوي على PBS مثلج لمدة 10 إلى 15 ثانية. ضع الدماغ المبرد في مصفوفة الدماغ على الجليد المواجه للجانب البطني لأعلى. لقطع الدماغ إكليليا ، أدخل شفرة الحلاقة الأولى عبر الحدود بين البصلة الشمية والساق الشمية. باستخدام ثلاث إلى أربع شفرات حلاقة إضافية ، قم بقطع الجزء الأمامي من الدماغ بشكل متسلسل على فترات 1 ملليمتر.

أمسك شفرات الحلاقة التي تم إدخالها معا لرفع الشرائح الإكليلية من مصفوفة الدماغ ، تاركا الجزء الخلفي وراءه. باستخدام الملقط ، افصل شفرات الحلاقة عن بعضها البعض ، وضعها على سطح مسطح مبرد بحيث تكون شريحة الدماغ متجهة لأعلى.

لأخذ عينات من قشرة الفص الجبهي ، اختر الشريحتين الثانية والثالثة خلف الشريحة الأولى التي تحتوي على السويقة الشمية. باستخدام لكمة الأنسجة أو الملقط ، قم بإزالة المنطقة المرغوبة. ضع المنديل على شفرة الحلاقة المبردة وقسمها بالتساوي إلى قطعتين. استخدم الطرف الدقيق من الملقط لفرم كل منديل إلى قطع على شفرة الحلاقة بحركات رأسية متعددة. قم برفع الأنبوب المبرد مسبقا الذي يحتوي على سائل دماغي نخاعي اصطناعي مع 30 ميكرولتر من محلول BS3. ثم انقل الأنسجة المفرومة على الفور إلى الأنبوب المطلوب.

لتفاعل الربط المتقاطع ، اقلب الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة والمحلول لتقسيم قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة. احتضان العينات على دوار الأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين ، وسجل وقت بدء حضانة BS3 لكل أنبوب. ثم قم بإخماد التفاعل ب 78 ميكرولتر من 1 جلايسين مولي. احتضن أكثر لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر ، وسجل وقت البدء والانتهاء للتبريد.