تقييم امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية ليرقات ذبابة الفاكهة مع استقلاب الجلوكوز المنظم

ضع يرقات ذبابة الفاكهة المتحولة في أطباق منفصلة تحتوي على عازل خال من الجلوكوز.

تشريح اليرقات لإزالة الأعضاء الداخلية ، وتعريض الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المركزي.

يشتمل الجهاز العصبي المركزي على حبل عصبي بطني يؤوي الخلايا العصبية الحركية. في اليرقات الطافرة ، تظهر هذه الخلايا العصبية استقلاب الجلوكوز upregulated upregulated

تعبر الخلايا العصبية الحركية في كلتا المجموعتين عن مستشعرات الجلوكوز داخل الخلايا التي تحتوي على فلوروفورات مانحة ومتقبلة.

ضع اليرقات تحت مجهر متحد البؤر. عند الإثارة ، ينبعث الفلوروفور المتبرع من الفلور.

حدد موقع الخلايا العصبية الحركية باستخدام هذا التألق.

استبدل المخزن المؤقت بمحلول مكمل بالغلوكوز.

يدخل الجلوكوز إلى الخلايا العصبية ، ويرتبط بالمستشعرات ويؤدي إلى تغيير توافقي يجلب الفلوروفورين على مقربة.

عند الإثارة ، يمتص المتقبل الطاقة المنبعثة من المتبرع ، والتي تسمى نقل طاقة الرنين الفلوري أو FRET ، وينبعث منها التألق.

ترتبط إشارة FRET بامتصاص الجلوكوز. تشير شدة إشارة المستقبل الأعلى في اليرقات الطافرة مقارنة بالتحكم إلى استقلاب الجلوكوز المنظم.

قبل البدء في التشريح ، قم بتشغيل مجهر التصوير والليزر. ثم اجمع يرقة الطور الثالث المتجولة. اشطفه بالماء المقطر المزدوج وضعه في قطرة من المخزن المؤقت HL3 على طبق مبطن بالتلاط الصناعي معد مسبقا.

بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، استخدم زوجا من الملقط لتثبيت الأطراف الأمامية والخلفية لليرقة ، الجانب الظهري لأعلى ، عن طريق تمديد اليرقة بالطول بعناية باستخدام دبابيس الحشرات. باستخدام زوج من مقص القزحية بزاوية ، قم بعمل شق فوق الدبوس الخلفي مباشرة. ثم قم بعمل قطع رأسي من الشق باتجاه الطرف الأمامي لليرقة.

بعد إضافة بضع قطرات من المخزن المؤقت HL3 ، إذا لزم الأمر ، قم بإزالة القصبة الهوائية وبقية الأعضاء العائمة دون إزعاج الجهاز العصبي المركزي. بعد ذلك ، قم بتثبيت اللوحات ، وتمتد جدار الجسم ، لفضح الجهاز العصبي المركزي مع الحفاظ على الجهاز العصبي العضلي سليما.

للحصول على الصور ، استخدم مجهر متحد البؤر عمودي مع عدسة غمر في الماء 40 مرة. ثم حدد الليزر 405 نانومتر لإثارة CFP. بعد ذلك ، قم بتحسين معلمات الاكتساب ، مثل سرعة المسح والمتوسط والهدف وحجم ثقب التكبير / التصغير والدقة المكانية. اضبط الكسب بحيث تكون الإشارة في النطاق الديناميكي الأمثل ، واستخدم نفس المعلمات لجميع الأنماط الجينية.

لتصوير الخلايا العصبية الحركية داخل الحبل العصبي البطني ، ضع طبق السيليكون مع العينة المقطوعة أسفل العدسة ، وقم بخفض العدسة بحيث تتلامس مع السكروز ثلاثي الهالوز HL3. تأكد من أن العدسة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت وأضف المزيد من المخزن المؤقت إذا لزم الأمر.

بعد ذلك ، باستخدام قنوات CFP و FRET ، حدد يدويا اختيارا بصريا يتكون من 6 خلايا عصبية حركية على الأقل في التركيز ، تقع على طول خط الوسط للحبل العصبي البطني. بعد ذلك ، احصل على صور كل 10 ثوان أو 10 دقائق. تمثل هذه الصور خط الأساس.

لتحفيز الجلوكوز ، قم بإزالة السكروز الثلاثي الهالوز المحتوي على المخزن المؤقت HL3 باستخدام ماصة باستور ، وأضف 5 مللي مولار مكملة بالجلوكوز HL3 العازلة دون تحريك الحبل العصبي البطني. بعد ذلك ، احصل على الصور كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق أخرى.

تمثل هذه الصور مرحلة التحفيز. احفظ الصور كملفات dot czi ، أو أي نوع ملف يدعمه برنامج التصوير باسم ملف بما في ذلك التاريخ والخلفية الجينية والحالة التجريبية والقنوات المستخدمة. أعيد استخدام المعلمات لتصوير جميع الأنماط الجينية.