تلطيخ مناعي للخلايا النجمية المصنفة بالفلورسنت في قسم أنسجة دماغ الفئران

خذ قسما ثابتا لأنسجة دماغ الفأر يحتوي على مجموعة متفرقة من الخلايا النجمية التي تعبر عن بروتين فلوريسنت.

عالج الجزء العائم بحرية بمحلول يحتوي على منظف لاختراق الخلايا.

احتضان القسم في مخزن مؤقت مانع لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

عالج القسم بالأجسام المضادة الأولية واحتضانه للسماح للأجسام المضادة بالارتباط ببروتينات الفلورسنت في الخلايا النجمية.

اغسل أي أجسام مضادة أولية زائدة باستخدام المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، احتضان القسم بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

اغسل الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة بمخزن مؤقت.

انقل القسم إلى خليط ماء منزوع الأيونات لإزالة بقايا المنظفات.

ضع القسم على شريحة تحتوي على ماء منزوع الأيونات العازلة. قم بإزالة السائل الزائد وإضافة وسائط التثبيت. ثم ضع غطاء وقم بتثبيته.

أخيرا ، استخدم الفحص المجهري متحد البؤر لتصور الخلايا النجمية التي تعبر عن البروتين الفلوري المسمى داخل القسم.

للبدء ، قم بإعداد محلول جديد من TBST عن طريق إضافة 1 مليلتر من 10٪ Triton X إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وملء الأنبوب إلى 50 مل ب TBS. قم بإعداد 2 مل من محاليل الحجب والأجسام المضادة لكل دماغ عن طريق الجمع بين مصل الماعز و TBST في أنبوب سعة 15 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بتسمية صفيحة مكونة من 24 بئرا لوضع عينات مختلفة في صفوف مختلفة ، في حلول مختلفة ، في أعمدة مختلفة. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من TBST إلى الأعمدة الثلاثة الأولى المسماة "Wash 1" و "Wash 2" و "Wash 3" ، وأضف 1 ملليلتر من محلول الحجب إلى العمود الرابع.

قم بإعداد عود زجاجي عن طريق إذابة نهاية ماصة باستور مقاس 5.75 بوصة في خطاف صغير باستخدام موقد بنسن. ثم انقل أقسام الأنسجة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى عمود "الغسيل 1" للوحة المكونة من 24 بئرا باستخدام الانتقاء. ثم اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق في كل من الآبار 1 و 2 و 3 باستخدام معول الزجاج لنقل الأقسام من بئر إلى آخر ، متبوعا باحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في محلول الحبس.

بعد ذلك ، احتضان الأقسام في الجسم المضاد الأولي لمدة ليلتين إلى ثلاث ليال عند 4 درجات مئوية أثناء الرج. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بالشفط في اليوم الأول من آبار الغسيل. ثم أضف 1 مليلتر من TBST الجديد إلى كل بئر غسيل ، وانقل الأقسام إلى بئر الغسيل الأول.

بعد ذلك ، احتضان الأقسام في الجسم المضاد الثانوي لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، استنشق يومي TBST من آبار الغسيل. ثم أضف 1 مليلتر من TBST الجديد إلى كل بئر غسيل وانقل الأقسام إلى بئر الغسيل الأول.

أثناء الغسيل النهائي ، أخرج وسائط التثبيت من 4 درجات مئوية واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإعداد خليط 2 إلى 1 من TBS في ماء منزوع الأيونات وأضفه إلى طبق بتري. بعد ذلك ، قم بإعداد شريحة مجهر عن طريق إضافة 800 ميكرولتر من خليط 2 إلى 1 من TBS في الماء منزوع الأيونات إلى السطح.

انقل الأقسام من "Wash 3" جيدا إلى طبق بتري. بعد ذلك ، باستخدام فرشاة رسم دقيقة ، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى من طبق بتري إلى السائل الموجود على الشريحة. بعد ذلك ، رتب الأقسام بعناية بحيث تكون مسطحة على الشريحة باستخدام فرشاة الرسم. قم بإزالة السائل الزائد بعناية من الشريحة باستخدام ماصة P1000 ، متبوعة بشفط الفراغ.

بمجرد إزالة كل السائل الزائد من الشريحة، استخدم ماصة النقل لإضافة قطرة واحدة من وسائط التثبيت على الفور إلى كل قسم ووضع غطاء برفق فوق الشريحة. اسمح لوسائط التركيب بالانتشار لبضع دقائق ، ثم قم بإزالة أي وسائط تثبيت زائدة تخرج من أسفل الغطاء عن طريق الشفط بالتفريغ. بعد ذلك ، أغلق جميع الحواف الأربعة للغطاء بطلاء أظافر شفاف.