التشريح المجهري بالليزر لعزل خلايا بركنجي من أنسجة المخيخ البشري بعد الوفاة

خذ نسيجا مخيخيا بشريا بعد الوفاة يحتوي على طبقات خلية بركنجي وحبيبات وخلايا جزيئية.

ضعه على حامل عينة ناظم البرد يحتوي على وسائط تضمين مجمدة جزئيا.

اترك الوسائط تتجمد تماما ، وتأمين الأنسجة.

انقل هذه المجموعة إلى ذراع قطع ناظم البرد واترك الأنسجة تتأقلم مع درجة حرارة ناظم البرد.

انقل الأنسجة بالقرب من الشفرة وقم بقصها لكشف طبقات القشرة.

ضع صفيحة مضادة للدحرجة فوق الشفرة واحصل على أقسام مخيخية.

انقل هذه الأقسام إلى شريحة غشائية.

احتضان في زيادة تركيزات الإيثانول لتثبيت الأنسجة والجفاف.

ثم احتضن في الزيلين.

جفف الشريحة وضعها على مرحلة مجهر التقاط الأشعة فوق البنفسجية.

ضع غطاء التجميع فوق الأنسجة المخيخية.

مجهريا ، ركز على خلايا بركنجي.

باستخدام الليزر ، التقط خلايا بركنجي واجمعها لمزيد من التحليل.

أولا ، قم بقص قطعة صغيرة من الأنسجة للتقسيم ، وتأكد من أن القسم يتكون من حوالي 95٪ من القشرة المخيخية. أعد الأنسجة المتبقية إما إلى الثلج الجاف أو إلى الفريزر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، ابدأ في إضافة OCT ببطء أعلى ظرف الظرف بحركة دائرية بطيئة. قم ببناء طبقات من OCT حتى يكون هناك كومة ، يبلغ ارتفاعها حوالي ثلاثة ملليمترات تغطي الظرف.

عندما يتم تجميد OCT جزئيا ، ولكن لا يزال يحتوي على بعض السوائل في المنتصف ، ضع الأنسجة فوق الكومة. دع المناديل تجلس فوق OCT لمدة 1 إلى 2 دقيقة حتى تتجمد تماما. بعد ذلك ، انقل ظرف الظرف مع OCT المجمد والأنسجة إلى ذراع قطع ناظم البرد. اضبط الأنسجة بحيث تتدفق بشفرة القطع ، واترك المناديل تجلس في ذراع القطع لمدة 20 دقيقة للتكيف مع درجة الحرارة الجديدة.

الخطوة الأكثر أهمية هي السماح للأنسجة بالتأقلم في ذراع قطع ناظم البرد طالما كان ذلك ضروريا. إذا تمزق الأنسجة ، فسيكون تصور خلايا بركنجي صعبا للغاية. أوصي باستخدام قطع أصغر وأرق من الأنسجة للسماح للأنسجة بالتأقلم بشكل أسرع.

بعد ذلك ، حرك الأنسجة ببطء بالقرب من الشفرة. بمجرد وصول الأنسجة إلى الشفرة ، ابدأ عملية التشذيب. تقليم الأنسجة من 2 إلى 3 مرات حتى تظهر طبقات القشرة.

بعد ذلك ، ضع اللوحة المضادة لللف وقم بمحاذاة فوق شفرة ناظم البرد. قم بقص 4 إلى 6 أقسام بسمك 14 ميكرومتر ، مع ملاحظة أن الأقسام المقطوعة بشكل صحيح ستكون مسطحة أسفل اللوحة المضادة للانزلاق. قم بمحاذاة الأقسام المقطوعة أفقيا عبر مرحلة ناظم البرد.

قم بزاوية شريحة لالتقاط جميع قطع المناديل في وقت واحد. مباشرة بعد تقسيم الأنسجة ، ضع الشريحة في حامل منزلق يحتوي على 70٪ من الإيثانول على الجليد لمدة دقيقتين. انقل الشريحة إلى حامل منزلق يحتوي على 95٪ إيثانول على الجليد لمدة 45 ثانية.

بعد ذلك ، ضع الشريحة في حامل منزلق يحتوي على 100٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. اغمس الشريحة 3 مرات في حامل الشريحة الذي يحتوي على الزيلين رقم 1 في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الشريحة في حامل شرائح مع الزيلين 2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع الشرائح لأعلى في غطاء دخان نظيف واتركها تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل.

أولا ، استخدم RNase مطهر لتنظيف مرحلة المجهر في ذراع جمع الغطاء. باستخدام يديك مرتدية قفازات ، ضع الشريحة على المجهر وغطاء معتم سعة 500 ميكرولتر في ذراع التجميع. عند التكبير المنخفض ، قم بمحاذاة الغطاء غير الشفاف فوق الأنسجة المخيخية ، مع التأكد من أن الغطاء يغطي المنطقة بأكملها التي يتم تصورها في العدسة.

استخدم هدفا من 5 مرات إلى 10 مرات لتصور طبقات المخيخ. ضع المؤشر فوق القسم الذي تتقاطع فيه الطبقة الجزيئية وطبقة الخلية الحبيبية. انتقل إلى التكبير 40 مرة ، وتصور خلايا بركنجي. ثم ابدأ في التقاطها.