JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 3:55 د • July 8th, 2025
قم بإذابة جزء من أنسجة دماغ الفئران المجمدة.
أضف العازلة وافرم الأنسجة. ثم انقله إلى أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت واخلطه.
الطرد المركزي الخليط والتخلص من المادة الطافية.
أضف محلول إنزيم محلل للبروتين إلى الأنسجة وأعد تعليقه باستخدام ماصة كبيرة القطر.
احتضان الخليط لتحطيم المصفوفة خارج الخلية ، وتخفيف الخلايا العصبية.
الطرد المركزي الخليط والتخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق شظايا الأنسجة في مخزن مؤقت مبرد وقم بماصتها بشكل متكرر لفصل الخلايا.
اسمح للحطام والخلايا غير المنفصلة بالاستقرار ، ثم انقل معلق الخلية المفردة إلى أنبوب جديد.
انقل الخلايا إلى الإيثانول المثلج واخلطها. احتضنها لإصلاح الخلايا وتنفاذها.
الطرد المركزي التعليق والتخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الخلايا العصبية في مخزن مؤقت بارد لمزيد من التحليل.
لفرم الأنسجة ، اترك العينات تذوب على لوح زجاجي بارد لمدة لا تزيد عن دقيقة واحدة قبل تغطية العينات في قطرة إلى قطرتين من محلول العازلة A. بعد ذلك ، أمسك شفرة حلاقة عمودية تماما على اللوحة ، قم بفرم الأنسجة 100 مرة في كل اتجاه متعامد. لفرم الأنسجة جيدا ، من الأهمية بمكان الحفاظ على الأنسجة رطبة باستخدام المخزن المؤقت A واتباع أوقات الفرم والاتجاه المحددين.
من الأهمية بمكان إزالة غالبية المادة البيضاء أثناء تشريح الأنسجة ، والحفاظ على الأنسجة مغطاة في المخزن المؤقت أ ، لتحسين كفاءة الفرم والحفاظ على صحة الخلايا.
عندما تتم معالجة الأنسجة بدقة ، استخدم شفرة الحلاقة لنقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مليلتر من المخزن المؤقت البارد A ، وقم بقلب الأنبوب ثلاث إلى خمس مرات لغمر كل الأنسجة المفرومة في المحلول. لفصل شظايا الأنسجة إلى معلق خلية واحدة ، قم بتكسير العينات عن طريق الطرد المركزي.
تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف ببطء 1 ملليلتر من محلول الإنزيم البارد المذاب حديثا أسفل الجدار الداخلي للأنبوب الدقيق واستخدم ماصة بقطر طرف كبير لشفط كل حبيبات على الفور وتوزيعها أربع مرات لتفريق قطع الأنسجة المفرومة. بعد ذلك ، قم بقلب الأنبوب الدقيق بسرعة لمنع الكريات من الالتصاق بقيعان الأنبوب ، واحتضان العينة بالخلط النهائي لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
في نهاية عملية الهضم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى وأضف 0.6 مل من المخزن المؤقت البارد A إلى الخلايا. باستخدام نفس طرف الماصة، قم على الفور بشفط الكريات وتوزيعها خمس مرات، ثم اختر ماصة زجاجية مقاس 1.3 ملم، واستخدمها لمعايرة العينات برفق 10 مرات.
ضع العينة على الجليد لمدة دقيقتين للسماح للحطام والخلايا غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنبوب. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، انقل 800 ميكرولتر من الخلايا من الأنبوب الأول للطافية التي تم جمعها إلى كل من أول أنبوبين من الإيثانول.
اقلب الأنابيب لخلط العينات. ثم ضع العينات على الثلج لمدة 15 دقيقة مع الخلط عن طريق الانعكاس كل 5 دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا. ثم عند لمس جدار الأنبوب الدقيق فقط ، استخدم ماصة دقيقة لإزالة جميع الأجزاء من كل مادة طافية باستثناء آخر 50 ميكرولترا ببطء.