تقييم حالة Palmitoylation لبروتينات غشاء الخلية من أنسجة دماغ الفئران

خذ بروتينات غشاء الخلية من أنسجة دماغ الفئران.

تظهر هذه البروتينات تعديلا بعد الترجمة مع مجموعات بالميتويل ، وهو حمض دهني ، مرتبط ببقايا السيستين.

أضف حاجزا مخزلا واحتضانه عند درجة حرارة عالية لكسر الروابط بين السيستين غير البالميتويلاتي ، مما يؤدي إلى تعريضها.

احتضان بكاشف مانع يرتبط بالسيستين المكشوف، تاركا فقط السيستين البالميتويليد متفاعل.

انقل المحلول واخلطه مع الكلوروفورم والميثانول والماء منزوع الأيونات ، وقم بطرده المركزي لترسيب البروتينات وإزالة أي شوائب. بعد ذلك ، أضف الميثانول وأجهزة الطرد المركزي وتخلص من أي ملوثات متبقية.

أضف عازلة ، صوتنة لإذابة الحبيبات ، ثم أجهزة الطرد المركزي وإزالة المواد غير القابلة للذوبان.

ضع كاشف الشق لإزالة مجموعات البالميتويل من السيستين البالميتويل.

كرر ترسيب الكلوروفورم والميثانول وإزالة أي شوائب.

احتضان ببوليمر يرتبط بالسيستين غير المسدودة ، مما يساعد على تحديد البروتينات البالميتويلية.

كرر ترسيب الكلوروفورم والميثانول وقم بإزالة أي بوليمرات غير مرتبطة.

أعد تعليق الحبيبات لمزيد من التحليل لحالة النخيل للبروتينات المعزولة.

أولا ، قم بتعطيل روابط ثاني كبريتيد عن طريق احتضان البروتين المذاب في 25 ميكرولتر من TCEP ، لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بحظر السيستين الحر عن طريق احتضان المحلول ب 12.5 ميكرولتر من محلول مخزون NEM لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، ابدأ عملية ترسيب الكلوروفورم والميثانول. انقل محلول البروتين من أنبوب سعة 1.5 ملليلتر إلى أنبوب بولي بروبلين أو زجاج يمكن طرده في دوار دلو متأرجح بسرعة متواضعة. أضف 2 مل من الميثانول ، والدوامة لفترة وجيزة. أضف 1 ملليلتر من الكلوروفورم ، والدوامة لفترة وجيزة. ثم أضف 1.5 مل من الماء منزوع الأيونات والدوامة لفترة وجيزة مرة أخرى.

إذا لزم الأمر ، اقلب الأنبوب لضمان الخلط الشامل. الطرد المركزي للعينات عند 3,000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في دوار دلو متأرجح. قم بإزالة المرحلة العليا من المحلول بعناية والتخلص منها في أنبوب. أضف 1.5 مل من الميثانول. امزج برفق ولكن جيدا عن طريق الانعكاس اللطيف للأنبوب ، مع الحرص على عدم تجزئة فطيرة البروتين غير الشفافة.

بالطرد المركزي للعينة عند 3,000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في دوار دلو متأرجح. باستخدام ماصة مصلية زجاجية ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المرحلة العلوية من المحلول دون إزعاج فطيرة البروتين. اشطف الحبيبات بعناية ب 1 ملليلتر من الميثانول ، واتركها تجف في الهواء لمدة 10 دقائق على الأقل.

مع اكتمال ترسيب الكلوروفورم والميثانول ، ابدأ في انقسام روابط بالميتويل ثيوستر عن طريق تعليق راسب البروتين في 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت أ. نقل إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. قم بتقطيع الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم قام بالطرد المركزي عند 13,000 مرة G أو أعلى و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.

انقل البروتين المذاب إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 375 ميكرولتر من المخزن المؤقت H أو Buffer T. بعد احتضان العينات لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، كرر ترسيب الكلوروفورم والميثانول. لإضافة mPEG إلى السيستين غير المحمي ، ابدأ بإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت A الذي يحتوي على 10 مللي مولار TCEP.

ثم انقل التعليق إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. أضف 25 ميكرولترا من محلول المخزون mPEG 5k واخلطه عن طريق سحب العينات. احتضن في درجة حرارة الغرفة مع دوران نهاية على نهاية. بعد 60 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة mPEG 5k غير المدمج عن طريق إجراء ترسيب الميثانول الكلوروفورم مرة أخرى.

أجهزة الطرد المركزي عند أكثر من 13,000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المرحلة العليا بعناية كما كان من قبل ، وتجنب الفطيرة الندفية السميكة. أضف 1 مليلتر من الميثانول واخلطه برفق ولكن جيدا. أجهزة الطرد المركزي عند أكثر من 13,000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية واشطف الحبيبات ب 1 مليلتر من الميثانول. مرة أخرى ، جهاز الطرد المركزي عند أكثر من 13,000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تجفيف الحبيبات بالهواء ، يتم تعليقها في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A بدون TCEP أو أي عامل اختزال.