الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين في يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام فحص ربط القرب

خذ جدار جسم ذبابة الفاكهة يرقات ، التي تتكون من عضلات تعصبها الخلايا العصبية الحركية لتشكيل تقاطعات عصبية عضلية أو NMJs.

يحتوي غشاء العضلات بعد المشبكي في NMJ على بروتينات مرتبطة بالغشاء المتفاعلة ، والتي يتم تصنيفها بالأجسام المضادة الأولية.

أضف مقايسة ربط القرب ، أو PLA ، المجسات التي تحتوي على أجسام مضادة ثانوية مترافقة مع قليل النوكليوتيدات أحادية الشريطة. احتضان المجسات لترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

اغسل أي مجسات غير مقيدة.

احتضان مع مخزن الربط الذي يحتوي على قليل النوكليوتيدات الموصل وإنزيمات الليغاز.

يسهل قرب البروتينات المتفاعلة ارتباط الموصل بالمجسات. ثم يسد Ligase الفجوات ، مما يؤدي إلى إنشاء حمض نووي دائري.

اغسل أي موصلات غير مرتبطة.

احتضان بمحلول تضخيم يحتوي على البوليميراز ، والذي يضخم الحمض النووي الدائري من خلال تضخيم الدائرة المتدحرجة.

مجسات الكاشف الموسومة بالفلوروفور في المحلول الصلب للحمض النووي المضخم ، وعند الإثارة تنتج إشارة فلورسنت.

قم بتركيب جدار الجسم على شريحة لتصور تفاعلات البروتين والبروتين المسمى بالفلورسنت في NMJ.

لبدء الفحص ، أضف 1 إلى 5 تخفيف في حجم إجمالي لا يقل عن 200 ميكرولتر لكل من مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للفأر ناقص ومسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للأرانب بالإضافة إلى 1٪ BSA إلى جدران الجسم. احتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد استخدام محلول الغسيل A لغسل جدران الجسم مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما ، أضف 1 إلى 40 مخففا من الليغاز في محلول ليغاز. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، استخدم محلول الغسيل A لغسل جدران الجسم مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما قبل إضافة 1 إلى 80 تخفيف من البوليميراز في محلول التضخيم. احتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

لتحضير العينات للتصوير ، استخدم عازلة الغسيل B لغسل جدران الجسم مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما. ثم استخدم مخففا بمقدار 100 × من المخزن المؤقت للغسيل B للقيام بغسيل نهائي لمدة دقيقة واحدة. قم بموازنة جدران الجسم في بضع قطرات من محلول التركيب لمدة 30 دقيقة على الأقل.

باستخدام ملقط دقيق ، انقل جدران الجسم بعناية إلى شريحة منصة بحيث تكون بشرتها متجهة لأسفل. ضعها في صفوف في نفس الاتجاه داخل قطرة أو اثنتين من محلول التركيب. ضع غطاء مقاس 22 ملم × 40 ملم فوق المستحضر ، مع الحرص على عدم توليد فقاعات هواء. بعد ذلك ، استخدم طلاء أظافر شفاف لإغلاق الشريحة.