تحديد قدرة الميتوكوندريا المعزولة على الاحتفاظ بالكالسيوم

ضع الميتوكوندريا المعزولة من خلايا الورم الأرومي العصبي في مخزن مؤقت يحتوي على صبغة فلورية غير منفذة للغشاء ومرتبطة بالكالسيوم.

احتضان للسماح للميتوكوندريا بالاستقرار في المخزن المؤقت.

أضف المخزن المؤقت المحتوي على الكالسيوم واحتضنه مع الرج.

ترتبط أيونات الكالسيوم بجزيئات الصبغة ، مما يتسبب في تألقها.

باستخدام مطياف التألق ، راقب مضان الصبغة في الوقت الفعلي.

الآن ، قم بحقن المخزن المؤقت المحتوي على الكالسيوم على فترات منتظمة.

يعزز تركيز الكالسيوم المتزايد امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا ، مما يقلل من أيونات الكالسيوم الحرة المتاحة للارتباط بالصبغة ، مما يؤدي إلى انخفاض الفلورة.

بمجرد أن تصل الميتوكوندريا إلى أقصى سعة لتخزين الكالسيوم ، تؤدي إضافة الكالسيوم الإضافية إلى فتح المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا (mPTP).

تطلق فتحة المسام هذه الكالسيوم من الميتوكوندريا إلى المخزن المؤقت ، حيث ترتبط بالصبغة وتسبب زيادة التألق.

تحديد الكمية الإجمالية للكالسيوم المطلوبة للحث على فتح mPTP ، مما يعكس قدرة الاحتفاظ بالكالسيوم في الميتوكوندريا.

قم بإعداد وسط كلوريد البوتاسيوم وأضف صبغة الفلورسنت الخضراء المرتبطة بالكالسيوم إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومولار قبل التجربة. لتحديد قدرة الاحتفاظ بالكالسيوم في الميتوكوندريا ، قم أولا بنقل 1 ملليلتر من الميتوكوندريا المعزولة في وسط كلوريد البوتاسيوم الذي يحتوي على 0.5 ميكرومولار صبغة فلورية خضراء ملزمة بالكالسيوم إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار.

احتضان الميتوكوندريا في صبغة الفلورسنت الخضراء المرتبطة بالكالسيوم في الصفيحة المكونة من 6 آبار في درجة حرارة الغرفة. احميته من الضوء المحيط لمدة 1 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 4 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم 20 ملليمولار إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار ، باستخدام إعداد التوزيع التلقائي لإدخال 200 نانومول من الكالسيوم لكل ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا.

استخدم مطياف الفلورسنت لمراقبة تغيرات التألق كل ثلاث ثوان لمدة دقيقتين ، بطول موجة إثارة يبلغ 506 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 531 نانومتر. تم تجهيز اللوحة بالاهتزاز عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثوان بين القراءات ، يتم التحكم فيها بواسطة البرنامج. أضف كمية إضافية من 4 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم 20 ملليمولار لكل بئر ، ثم راقب التغيرات الفلورية كل 3 ثوان لمدة دقيقتين.