الكيمياء المناعية لأقسام أنسجة دماغ الفئران لاستهداف الخلايا العصبية الدوبامين

خذ شريحة مطلية بالبوليمر مع أقسام أنسجة دماغ الفئران تحتوي على خلايا عصبية الدوبامين التي تعبر عن هيدروكسيلاز التيروزين، وهو إنزيم رئيسي لتخليق الدوبامين.
حدد الأقسام بقلم كاره للماء لضمان تلطيخ موحد.
قم بإصلاح الأنسجة في محلول الأسيتون والميثانول للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة.
اشطفه بمحلول عازل يحتوي على منظف لاختراق أغشية الخلايا.
احتضن بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف هيدروكسيلاز التيروزين في الخلايا العصبية الدوبامين ، ثم اغسلها لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
أضف الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الفلورية والصبغة النووية ومثبطات RNase.
أثناء الحضانة ، ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالأجسام المضادة الأولية ، وتصنف الأصباغ النووية النواة ، وتعمل مثبطات RNase على تعطيل RNases.
اشطفها بمخزن مؤقت. بعد ذلك ، قم بتجفيف أقسام الأنسجة بتركيزات متزايدة من الإيثانول.
احتضان في الزيلين لتنظيف الأنسجة.
أقسام الأنسجة المعالجة جاهزة الآن للتشريح الدقيق لالتقاط الليزر ، مما يسمح بالتصور الدقيق وتشريح الخلايا العصبية الدوبامين المستهدفة.

لإجراء الكيمياء المناعية ، استخدم قلما كارها للماء لتحديد الخطوط العريضة للأنسجة والسماح لها بالجفاف. ثم ، في محلول ميثانول الأسيتون من 1 إلى 1 ، قم بإصلاح الأنسجة عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إزالة الأنسجة من الفريزر ، قم بتغطية الأقسام ب 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد للتيروزين هيدروكسيلاز في PBS و 1٪ تريتون لمدة 10 دقائق.

then, استخدم PBS مع 1٪ triton لشطف الشرائح قبل تغطية الأقسام ب 100 إلى 200 ميكرولتر من IgG المضاد للأرانب للماعز ، المسمى Alexa Fluor 488. احتضن لمدة خمس دقائق ، ثم استخدم PBS لشطف الشرائح مرتين. بعد ذلك ، قم بتجفيف العينات في سلسلة متدرجة من الإيثانول الخالي من RNase لمدة 30 ثانية لكل منها ، كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. احتضن في الزيلين لمدة دقيقة وغسل ثان لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الشرائح مباشرة قبل استخدامها مع المضاعف المشترك الأصغر واتركها تجف في الهواء.