دراسة تهريب البروتين الغشائي في ذبابة الفاكهة الخلايا المستقبلة للضوء

خذ ذبابة بيضاء العينين ومخدرة ومعدلة وراثيا ومتكيفة مع الظلام.

تعبر الذبابة عن قنوات أيون TRPL الموسومة بعلامة eGFP في المستقبلات الضوئية للعين.

في الظلام، يتم توطين TRPL في أغشية المخططات - الزغابات الدقيقة للمستقبلات الضوئية.

باستخدام الهواء المضغوط، ادفع الذبابة رأسا على عقب إلى طرف الماصة.

قم بقص الطرف وادفع الذبابة للخلف.

قم بقصها مرة أخرى وادفع الذبابة للأمام حتى يبرز رأسها فقط.

قم بتثبيت الطرف في طين النمذجة الملتصق بشريحة وضعها على مرحلة المجهر الفلوري، بحيث تواجه العين هدف المجهر شعاعيا.

أضف قطرة ماء إلى الهدف، ثم اخفضها حتى تلامس العين.

التقط صورا للمستقبلات الضوئية.

قياس شدة التألق في المخططات وجسم الخلية والخلفية.

قم بإضاءة الذبابة بضوء برتقالي للحث على نقل TRPL إلى جسم الخلية.

كرر قياسات التصوير والتألق.

قارن الصور لملاحظة انخفاض التألق الربيدي بعد الإضاءة ، مما يشير إلى انتقال TRPL إلى جسم الخلية.

لتحضير ذبابة في شكل غير مميت ، انقل الذبابة المخدرة بالثلج رأسا على عقب إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وادفع الذبابة بعناية نحو الحافة بالهواء المضغوط. ثم ، باستخدام مشرط ، اقطع طرف الماصة أمام الرأس مباشرة. وباستخدام الملقط ، ادفع الذبابة بحذر بضعة ملليمترات في طرف الماصة.

اقطع طرف الماصة مرة أخرى. وادفع الذبابة للخلف باتجاه الحافة بالهواء المضغوط ، بحيث يبرز رأس الذبابة فقط من طرف الماصة. بعد لصق قطعة من البلاستيسين على شريحة جسم ، اضغط على طرف الماصة بداخلها بحيث تتجه العين اليسرى أو اليمنى لأعلى. تأكد من توجيه العين بشكل صحيح تحت المجهر. للحصول على الصور، حدد هدف الغمر في الماء.

في حالة الاختلاف غير المميت، استخدم ماصة مختبرية للصق قطرة كبيرة من الماء المبرد على الجانب السفلي من هدف الغمر في الماء. ضع شريحة الكائن بعناية مع الذبابة المعدة على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، قم بخفض هدف الغمر في الماء يدويا حتى يلامس سطح الماء ، أو تلمس عين الذبابة القطرة.

بعد ذلك ، قم بتبديل مسار الضوء نحو كاميرا المجهر ، وقم بإنشاء صورة حية. أعد ضبط التركيز للكاميرا وقم بتقييم اتجاه العين ، مع الأخذ في الاعتبار أن العين يجب أن تواجه هدف المجهر شعاعيا. استخدم برنامج جدول البحث للكشف عن التشبع الزائد.

في حالة الذباب غير المصطبغ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون وحدات البكسل الأكثر سطوعا أقل بقليل من حد التشبع لكل صورة. سجل صورة واحفظها كملف خام لأرشفة جميع البيانات الوصفية المقابلة للتسجيل. بعد ذلك ، قم بتصدير الصورة بتنسيق TIFF نقطي.

لتحديد التألق النسبي ل EGFP في مخططات الصور المجهرية بالغمر في الماء ، اضبط إعدادات ImageJ بالنقر فوق تحليل. بعد ذلك ، قم بتعيين القياسات ، وحدد فقط المربع لمتوسط القيمة الرمادية. قم باستيراد صورة TIFF النقطية بالنقر فوق ملف ، ثم فتح. اختر منطقة تمثيلية للصورة قيد التركيز البؤري، وقم بتكبيرها إلى 200٪ إلى 300٪ عن طريق الضغط بشكل متكرر على Control وPlus معا.

بعد ذلك ، حدد أداة Oval. وأثناء الضغط على مفتاح Shift ، قم بإنشاء تحديد دائري في الصورة أصغر بكثير من ربيدة فلورسنت. بعد ذلك ، ابحث عن الحجم الدقيق المعروض أسفل شريط الأدوات في نافذة ImageJ الرئيسية. لقياس شدة التألق داخل التحديد الدائري، حرك الدائرة إلى المخططات الأولى باستخدام مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح، ثم انقر فوق تحليل، ثم القياس.

ستظهر نافذة نتيجة تسرد القيمة الرمادية المقاسة. استمر في قياسات الربدومير من 2 إلى 6 ، وقم أيضا بقياس إشارة الخلفية. في حالة الذباب غير المصطبغ ، قم بإجراء قياسات إضافية لمناطق جسم الخلية المقابلة. قم بقياس تألق اثنين من الأوماتيديا الأخرى ، مما ينتج عنه ثلاث تكرارات تقنية. ضع علامة على ommatidia التي تم تحليلها باستخدام أداة القلم الرصاص واحفظ هذه الصورة للتوثيق.

حدد وانسخ القيم الرمادية المقاسة من نافذة النتائج والصقه في برنامج جداول البيانات لمزيد من العمليات الحسابية. قم بفرز قيم شدة التألق وفقا لأصلها في ربيدومير الفئة وجسم الخلية والخلفية ، واحسب متوسط الشدة من كل فئة. ثم احسب الكمية النسبية من EGFP الموجودة في الربدوم ، باستخدام الصيغة الأولى للعيون غير المصطبغة ، والثانية للعيون المصطبغة.