الكشف عن تعديلات الهيستون في خلايا الخميرة مع الإفراط في التعبير عن البروتين التنكسي العصبي

ابدأ بتعليق خلايا الخميرة التي تفرط في التعبير عن البروتينات المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية.

هذا البروتين المفرط في التعبير مسؤول عن التعديلات في بروتينات تغليف الحمض النووي أو الهستونات ذات الشقوق الكيميائية.

أضف هيدروكسيد الصوديوم وبيتا ميركابتو إيثانول ثم احتضانه على الجليد.

هيدروكسيد الصوديوم وبيتا ميركابتو إيثانول يحلل الخلايا، مما يؤدي إلى إطلاق البروتينات داخل الخلايا، بما في ذلك الهستونات.

الطرد المركزي للمحللة لجمع البروتينات. تخلص من المادة الطافية.

أضف صبغة تحميل إلى حبيبات البروتين وقم بتسخينها لتشويهها.

قم بتحميل هذه البروتينات المشوهة وعلامة البروتين على الجل والكهربائي لفصلها حسب الحجم.

انقل البروتينات كهربائيا إلى غشاء واغسلها وأضف حاجزا حاجب لمنع الارتباط غير المحدد.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط على وجه التحديد بالهيستونات المعدلة.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

يؤكد شريط الفلورسنت المميز تعديلات الهيستون، مما يشير إلى الإفراط في التعبير عن البروتينات التنكسية العصبية.

لتحلل الخلايا لتحليل اللطخة الغربية ، قم بإذابة كريات خلايا الخميرة على الجليد قبل إعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف 300 ميكرولتر من 0.2 مولي هيدروكسيد الصوديوم ، و 20 ميكرولتر من 2-Merc