الكشف عن تعديلات الهيستون في خلايا الخميرة مع الإفراط في التعبير عن البروتين التنكسي العصبي

ابدأ بتعليق خلايا الخميرة التي تفرط في التعبير عن البروتينات المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية.

هذا البروتين المفرط في التعبير مسؤول عن التعديلات في بروتينات تغليف الحمض النووي أو الهستونات ذات الشقوق الكيميائية.

أضف هيدروكسيد الصوديوم وبيتا ميركابتو إيثانول ثم احتضانه على الجليد.

هيدروكسيد الصوديوم وبيتا ميركابتو إيثانول يحلل الخلايا، مما يؤدي إلى إطلاق البروتينات داخل الخلايا، بما في ذلك الهستونات.

الطرد المركزي للمحللة لجمع البروتينات. تخلص من المادة الطافية.

أضف صبغة تحميل إلى حبيبات البروتين وقم بتسخينها لتشويهها.

قم بتحميل هذه البروتينات المشوهة وعلامة البروتين على الجل والكهربائي لفصلها حسب الحجم.

انقل البروتينات كهربائيا إلى غشاء واغسلها وأضف حاجزا حاجب لمنع الارتباط غير المحدد.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط على وجه التحديد بالهيستونات المعدلة.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

يؤكد شريط الفلورسنت المميز تعديلات الهيستون، مما يشير إلى الإفراط في التعبير عن البروتينات التنكسية العصبية.

لتحلل الخلايا لتحليل اللطخة الغربية ، قم بإذابة كريات خلايا الخميرة على الجليد قبل إعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف 300 ميكرولتر من 0.2 مولي هيدروكسيد الصوديوم ، و 20 ميكرولتر من 2-Mercaptoethanol لكل عينة خلية. وأعد تعليق الكريات عن طريق سحب العينات.

بعد حضانة لمدة 10 دقائق على الجليد ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق العينات في 100 ميكرولتر من صبغة التحميل. ثم اغلي العينات لمدة 10 دقائق على كتلة تسخين. أثناء تحلل العينات ، ضع اثنين من المواد الهلامية في حامل الجل ، واملأ الغرفة الداخلية إلى الأعلى بمخزن مؤقت للتشغيل والغرفة الخارجية إلى علامة خط الهلام.

عندما تكون العينات جاهزة ، قم بتحميل 15 ميكرولترا لكل محلول تحلل خلية في كل بئر من هلام بولي أكريلاميد 10 آبار بنسبة 12٪ وأضف 5 ميكرولترات من سلم البروتين إلى حارة سلم البروتين جيدا. قم بتشغيل الجل لمدة 45 دقيقة تقريبا عند 150 فولت أو حتى تصل مقدمة صبغة التحميل إلى قاع الجل.

أثناء تشغيل الجل ، انقع وسادتين من الألياف لكل هلام في مخزن مؤقت للنقل ، وغشاء واحد من فلوريد البولي فينيلدين أو PVDF لكل هلام في الميثانول. عندما يصبح الجل جاهزا ، اشطف الغشاء وانقل المخزن المؤقت. ووضع وسادة ألياف منقوعة مسبقا في الجزء السفلي من خلية جهاز النقل شبه الجافة ، متبوعة بغشاء PVDF ، والهلام ، ووسادة الألياف الثانية المنقوعة مسبقا.

ثم اضبط الطاقة على 150 مللي أمبير لمدة 1 ساعة. في نهاية نقل البروتين ، قم بإزالة الغشاء من جهاز النقل لشطفه لفترة وجيزة بالماء المقطر. ضع جانب البروتين الغشائي المغسول لأعلى في صندوق تلطيخ صغير ، وقم بتغطية الغشاء بمحلول ملحي مخزن ثلاثي أو مانع TBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.

في نهاية حضانة الحضانة ، احتضان الغشاء طوال الليل باستخدام هيستون مضاد للخميرة وجسم مضاد محدد للتعديل في TBS عند 4 درجات مئوية ، وجسم مضاد مناسب للتحكم في التحميل النووي.

في صباح اليوم التالي ، اغسل الغشاء أربع مرات في TBS ، مع استكمال 0.1٪ بولي سوربات 20 لمدة خمس دقائق مع التأرجح في درجة حرارة الغرفة لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، احتضن اللطخة بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، تليها أربع غسلات لمدة 5 دقائق في TBST وغسل واحد لمدة خمس دقائق في TBS وحده مع الهزاز.

ثم قم بتصوير اللطخة على نظام تصوير اللطخة الغربية الفلورية لمدة دقيقتين.