موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 4:37 دقيقة • April 28th, 2025
ابدأ بأنسجة المخ من فأر معدل وراثيا يفرط في التعبير عن α-synuclein المتحور ، وهو بروتين عصبي غير مطوي مرتبط بمرض تنكسي عصبي ، مغمور في مخزن مؤقت عالي الملح.
قم بتجانس الأنسجة بمدقة كبيرة ، متبوعة بمدقة صغيرة لتعطيل الأنسجة وإطلاق البروتينات داخل الخلايا ، بما في ذلك α-سينوكلين.
نقل المتجانس إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي. اجمع المادة الطافية المحتوية على البروتين وقم بتخفيفها بمخزن مؤقت.
أضف هذا المادة الطافية إلى صفيحة دقيقة مطلية بالأجسام المضادة الخاصة بالسينوكلين α المعالجة مسبقا بعامل مانع لمنع الارتباط غير المحدد.
احتضان مع التحريض ، مما يسمح للارتباط α-synuclein الطبيعي والمتحور.
اغسل اللوحة ، ثم أضف الأجسام المضادة للكشف الخاصة ب α-synuclein المتحور واحتضنه بالتحريض.
اغسل مرة أخرى وأضف الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم ، متبوعا بالحضانة تحت التحريض.
أضف الركيزة واحتضانها في الظلام تحت التحريض. تتفاعل الركيزة مع الإنزيم لإنتاج تغيير في اللون.
أوقف التفاعل بالحمض وقم بقياس الامتصاص لتحديد α-synuclein المتحور.
لتحضير متجانسات الدماغ ، أضف حجما مناسبا من المخزن المؤقت ل HS إلى مناطق الدماغ التي تم تشريحها للوصول إلى نسبة مئوية متوقعة من التجانس ، كما هو موضح في الجدول أدناه. باستخدام مطحنة الأنسجة المكونة من أنبوب زجاجي من البورسليكات ومدقتين ، A و B ، اسكب منطقة في الدماغ ليتم سحقها في الأنبوب. ثم باستخدام المدقة أ ، قم بتجانس الأنسجة 10 مرات لفصلها.
ثم قم بالتبديل إلى المدقة B وقم بتجانس 20 مرة إضافية. باستخدام ماصة النقل ، انقل الجانس إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، مع تكرار التجانس مع عينات الدماغ المتبقية. الطرد المركزي للعينات عند 1,000 غرام لمدة خمس دقائق ، عند أربع درجات مئوية. ثم اجمع المواد الطافية وقسمها إلى حصص 200 ميكرولتر.
باستخدام 100 ميكرولتر من محلول طلاء الجسم المضاد ، قم بتغطية آبار 96 صفيحة دقيقة واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف 300 ميكرولتر من PBST إلى الآبار ، واستخدم غسالة الألواح لغسل الألواح خمس مرات. أثناء العمل في درجة حرارة الغرفة ، للمضي قدما ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحجب T20 PBS إلى كل بئر ، وقم بهز الألواح عند 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل استخدام PBST لغسل الألواح خمس مرات.
باستخدام PBST ، 1٪ من BSA ، قم بتخفيف تجانس الدماغ باستخدام الإرشادات المدرجة هنا. وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة و 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين قبل استخدام PBST لغسل الأطباق خمس مرات.
بعد الغسيل النهائي ، أضف الأجسام المضادة اللازمة للكشف عن ألفا سينوكلين المخففة في PBST و 1٪ BSA كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص. احتضن في درجة حرارة الغرفة و 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل غسل الأطباق خمس مرات كما كان من قبل.
بعد ذلك ، أضف إما مضاد للفأر أو مضاد للأرانب IGG HRP مقترف إلى 1 إلى 8,000 في PBST ، 1٪ BSA. واحتضن عند 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل غسل الأطباق خمس مرات. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB إلى كل بئر ، واحتضنه عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في الظلام. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك العادي لكل بئر. بعد ذلك ، استخدم قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس الامتصاص عند 450 نانومتر.