الكشف عن البروتين المرتبط بالأمراض التنكسية العصبية α-Synuclein باستخدام ELISA
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 4:37 د • April 28th, 2025
ابدأ بأنسجة المخ من فأر معدل وراثيا يفرط في التعبير عن α-synuclein المتحور ، وهو بروتين عصبي غير مطوي مرتبط بمرض تنكسي عصبي ، مغمور في مخزن مؤقت عالي الملح.
قم بتجانس الأنسجة بمدقة كبيرة ، متبوعة بمدقة صغيرة لتعطيل الأنسجة وإطلاق البروتينات داخل الخلايا ، بما في ذلك α-سينوكلين.
نقل المتجانس إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي. اجمع المادة الطافية المحتوية على البروتين وقم بتخفيفها بمخزن مؤقت.
أضف هذا المادة الطافية إلى صفيحة دقيقة مطلية بالأجسام المضادة الخاصة بالسينوكلين α المعالجة مسبقا بعامل مانع لمنع الارتباط غير المحدد.
احتضان مع التحريض ، مما يسمح للارتباط α-synuclein الطبيعي والمتحور.
اغسل اللوحة ، ثم أضف الأجسام المضادة للكشف الخاصة ب α-synuclein المتحور واحتضنه بالتحريض.
اغسل مرة أخرى وأضف الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم ، متبوعا بالحضانة تحت التحريض.
أضف الركيزة واحتضانها في الظلام تحت التحريض. تتفاعل الركيزة مع الإنزيم لإنتاج تغيير في اللون.
أوقف التفاعل بالحمض وقم بقياس الامتصاص لتحديد α-synuclein المتحور.
لتحضير متجانسات الدماغ ، أضف حجما مناسبا من المخزن المؤقت ل HS إلى مناطق الدماغ التي تم تشريحها للوصول إلى نسبة مئوية متوقعة من التجانس ، كما هو موضح في الجدول أدناه. باستخدام مطحنة الأنسجة المكونة من أنبوب زجاجي من البورسليكات ومدقتين ، A و B ، اسكب منطقة في الدماغ ليتم سحقها في الأنبوب. ثم باستخدام المدقة أ ، قم بتجانس الأنسجة 10 مرات لفصلها.
ثم قم بالتبديل إلى المدقة B وقم بتجانس 20 مرة إضافية. باستخدام ماصة النقل ، انقل الجانس إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، مع تكرار التجانس مع عينات الدماغ المتبقية. الطرد المركزي للعينات عند 1,000 غرام لمدة خمس دقائق ، عند أربع درجات مئوية. ثم اجمع المواد الطافية وقسمها إلى حصص 200 ميكرولتر.
باستخدام 100 ميكرولتر من محلول طلاء الجسم المضاد ، قم بتغطية آبار 96 صفيحة دقيقة واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف 300 ميكرولتر من PBST إلى الآبار ، واستخدم غسالة الألواح لغسل الألواح خمس مرات. أثناء العمل في درجة حرارة الغرفة ، للمضي قدما ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحجب T20 PBS إلى كل بئر ، وقم بهز الألواح عند 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل استخدام PBST لغسل الألواح خمس مرات.
باستخدام PBST ، 1٪ من BSA ، قم بتخفيف تجانس الدماغ باستخدام الإرشادات المدرجة هنا. وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة و 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين قبل استخدام PBST لغسل الأطباق خمس مرات.
بعد الغسيل النهائي ، أضف الأجسام المضادة اللازمة للكشف عن ألفا سينوكلين المخففة في PBST و 1٪ BSA كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص. احتضن في درجة حرارة الغرفة و 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل غسل الأطباق خمس مرات كما كان من قبل.
بعد ذلك ، أضف إما مضاد للفأر أو مضاد للأرانب IGG HRP مقترف إلى 1 إلى 8,000 في PBST ، 1٪ BSA. واحتضن عند 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل غسل الأطباق خمس مرات. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB إلى كل بئر ، واحتضنه عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في الظلام. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك العادي لكل بئر. بعد ذلك ، استخدم قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس الامتصاص عند 450 نانومتر.
نظرة عامة
توضح هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً للكشف عن بروتين α-synuclein المرتبط بالمرض في أنسجة دماغ الفئران المعدلة وراثياً والتي تفرط في تعبير بروتين α-synuclein البشري المتحور A53T، وذلك باستخدام طريقة ELISA المحسنة. يتيح هذا الإجراء تقديراً كمياً حساساً لكل من الأشكال الطبيعية والمتحورة من α-synuclein، وهو أمر ذو صلة بأبحاث الأمراض التنكسية العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- أبحاث الأمراض التنكسية العصبية
- الكيمياء الحيوية للبروتينات
خلفية علمية
- يعد α-synuclein بروتيناً عصبياً مرتبطاً بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون.
- ترتبط طفرات مثل A53T في α-synuclein بالباثولوجيا المرضية.
- يعد قياس كمية α-synuclein المرتبط بالمرض في أنسجة الدماغ أمراً هاماً لفهم آليات المرض وتطوره.
- يوفر اختبار ELISA طريقة حساسة ومحددة للكشف عن البروتين في العينات البيولوجية.
الغرض من الدراسة
- تأسيس بروتوكول قوي للكشف عن α-synuclein المتحور وتقديره كمياً في أنسجة دماغ الفأر.
- تمكين التمييز بين الأشكال الطبيعية وأشكال α-synuclein المرتبطة بالمرض.
- توفير طريقة قابلة للتكرار للاستخدام في نماذج الأمراض التنكسية العصبية.
الطرق المستخدمة
- تشريح وتجانس أنسجة الدماغ من الفئران المعدلة وراثيًا في محلول منظم عالي الملوحة باستخدام مدقات زجاجية.
- الطرد المركزي لفصل الطافي المحتوي على البروتين وتحضير العينات المقسمة.
- طلاء أطباق مجهرية ذات 96 بئرًا بأجسام مضادة محددة لـ α-synuclein وعملية الحجب لمنع الارتباط غير النوعي.
- تحضين متجانسات الدماغ المخففة في الآبار المطلية، يلي ذلك تحضين متسلسل مع أجسام مضادة للكشف وأجسام مضادة ثانوية مرتبطة بالإنزيم.
- الكشف اللوني باستخدام ركيزة TMB وقياس الامتصاصية عند 450 nm لتقدير مستويات α-synuclein.
النتائج الرئيسية
- يتيح هذا البروتوكول الكشف الحساس عن كل من بروتين α-synuclein الطبيعي والطافر في متجانسات دماغ الفئران.
- يسمح اختبار ELISA المعزز بتحديد كمية أشكال α-synuclein المرتبطة بالمرض.
- تظهر الطريقة نوعيتها من خلال استخدام أجسام مضادة للكشف متخصصة في الطفرات.
- يمكن استخدام النتائج لمقارنة مستويات α-synuclein عبر المجموعات التجريبية المختلفة أو نماذج الأمراض.
الاستنتاجات
- يوفر بروتوكول ELISA المحسن هذا نهجاً موثوقاً وحساساً للكشف عن بروتين α-synuclein المرتبط بالمرض في أنسجة الدماغ.
- تعد هذه الطريقة مناسبة للدراسات التي تبحث في دور α-synuclein في الأمراض التنكسية العصبية.
- كما أنها تسهل التحليل الكمي للاعتلال البروتيني في نماذج الفئران المعدلة وراثياً.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح الكشف الكمي عن بروتين α-synuclein المرتبط بالأمراض باستخدام تقنية ELISA التحقق القوي من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في أبحاث الأمراض التنكسية العصبية. ويدعم سير العمل هذا الثقة التنبؤية في نقاط التحول المبكرة للاكتشاف والمراحل ما قبل السريرية، مما يوجه قرارات المحفظة الاستثمارية للبرامج العلاجية التي تستهدف اعتلالات البروتين. كما يشكل القياس الموثوق لمستويات α-synuclein المتحور في النماذج المعدلة وراثياً ركيزة للاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق ما قبل السريري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استجواب α-synuclein كهدف ذي صلة بالمرض في نماذج التنكس العصبي.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التمييز بين أشكال البروتين الطبيعية والمطفرة.
- يوفر بيانات كمية لتعزيز الثقة التنبؤية في دراسات ارتباط الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- يقدم مخرجات مقايسة ELISA موثقة وقابلة للتكرار لعمليات فحص المركبات اللاحقة.
- يسهل توحيد المقايسة وقابليتها للتوسع عبر المجموعات التجريبية.
- يتيح إجراء مقارنة موثوقة لمستويات α-synuclein بين المجموعات التجريبية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتماشى مع تقدير كمية المؤشرات الحيوية ذات الصلة بالمرض في نماذج الفئران المعدلة وراثياً.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف المبكر وصولاً إلى التحقق قبل السريري من الفرضيات العلاجية.
- يوجه قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر بناءً على التحليل الكمي للمسارات المرضية للبروتينات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل طريقة الكشف هذه القائمة على مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية لبرامج الأمراض التنكسية العصبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: توفر اختباراً كمياً للفرضيات المتعلقة بدور α-synuclein في نماذج الأمراض.
- الفحص المسحي: توفر مخرجات قياس كمية وقابلة للتكرار لتقييم المركبات.
- التحليلات: تتيح قياس مستويات البروتين استناداً إلى الامتصاصية لإجراء المقارنات الإحصائية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج الاكتشاف بالتحقق من المؤشرات الحيوية في المرحلة ما قبل السريرية في النماذج ذات الصلة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة معيارية وقابلة للتكيف لتقدير كمية البروتين عبر مسارات أبحاث التنكس العصبي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الآلي في التحقق من صحة الهدف.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في سير عمل الكشف عن البروتين.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف وكفاءة رأس المال من خلال توفير بيانات كمية قوية.
- تأثير المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر والتقدم في أصول الأمراض التنكسية العصبية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الكيمياء الحيوية للبروتين وتطوير مقايسة ELISA.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة، وأجسام مضادة مصادق عليها، وكواشف قياسية.
- يستلزم توحيداً دقيقاً بين الفرق لبروتوكولات التجانس والمقايسة.
- قابل للتكيف مع مختلف الأنظمة النموذجية المعدلة وراثياً أو ذات الصلة بالأمراض من خلال اختيار الجسم المضاد المناسب.
- يعتمد على التحضير الدقيق للعينة وضوابط الحضانة لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
جيل من الورم الليفي الفا Synuclein المكونة مسبقا من مونومرات واستخدامها في فيفو
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكشف عن ألفا سينوكلين الفسفوري باستخدام النشاف الغربي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
مقايسة التألق المناعي للكشف عن مجاميع ألفا سينوكلين في قسم خزعة الجلد
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التلوين المناعي للخلايا العصبية المعالجة بمجاميع ألفا سينوكلين
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكشف عن الأمراض المرتبطة α-synuclein التي كتبها المحسن ELISA في دماغ الفئران المعدلة وراثيا Overexpressing A53T الإنسان تحور α-synuclein
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
إدارة خارجية من المجاميع المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلية قوية لتشكيل ييفات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026