الكشف عن ناقل كلوريد البوتاسيوم العصبي الفسفوري 2 عبر النشاف الغربي

خذ محللة خلوية تحتوي على ناقل كلوريد البوتاسيوم 2، أو بروتينات KCC2، التي تنظم مستويات كلوريد الخلايا العصبية.

الفسفرة في المواقع التنظيمية تعطل وظيفة KCC2 ، مما يعدل النشاط العصبي.

أضف المحللة إلى الخرزات المترافقة مع الأجسام المضادة التي تستهدف KCC2 الفسفورية. احتضن للسماح بالارتباط ، ثم اغسلها لإزالة البروتينات غير المرتبطة والحطام الخلوي.

تعامل مع مخزن مؤقت متغير عند درجة حرارة عالية لإطلاق KCC2 ، ثم جهاز الطرد المركزي لفصل الخرز.

قم بتحميل المادة الطافية المحتوية على KCC2 على هلام الرحلان الكهربائي. افصل البروتينات إلى نطاقات لتأكيد وجود KCC2 الفسفوري.

انقل العصابات إلى غشاء ، ثم احتضن في محلول حجب لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.

احتضن بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف KCC2 الفسفوري.

اغسل ، ثم احتضن بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالإنزيم لتسمية الأجسام المضادة الأولية.

اغسل مرة أخرى ، ثم أضف ركيزة كيميائية ، والتي تتفاعل مع الإنزيم لإنتاج الضوء.

قياس شدة الضوء لتحديد KCC2 الفسفوري في المحللة.

piette 300 ميكرولتر من البروتين G sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 500 جم لمدة دقيقتين. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من PBS والدوامة جيدا. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي ، وكرر هذه الخطوة.

بعد ذلك ، امزج 1 ملليغرام من الأجسام المضادة للثريونين 906 المضادة ل KCC2 والمضادة ل KCC2 threonine 1007 مع 200 ميكرولتر من حبات البروتين G سيفاروز ، قبل تكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر باستخدام PBS. بعد الاهتزاز على منصة اهتزازية ، أو عجلة دوارة لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ، كرر غسلتين باستخدام PBS.

قم بإجراء قياس كمية البروتين على محللات الخلية، وأضف 1 ملليغرام من محللة الخلية إلى الخرز المغسول واحتضانه في دوار من طرف إلى طرف قبل الدوران لأسفل. أعط ثلاث غسلات مع PBS تحتوي على 150 مللي مولر كلوريد الصوديوم ، متبوعة بثلاث غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS قبل تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة LDS.

رج الأنابيب في شاكر دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. احتضنها في كتلة تسخين ، وقم بطردها قبل استخدام المادة الطافية لتحميل الجل. قم بتجميع جهاز صب اللطخة الغربية وصب جل فصل طازج بنسبة 8٪ لصب الجل ، مما يتيح حوالي 2 سم من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.

قم بإزالة الأيزوبروبانول باستخدام ماصة، واشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر. بعد إضافة جل التكديس الطازج بنسبة 6٪ إلى إعداد الصب ، ضعه برفق في مشط البئر واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتثبيت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي.

بعد صب المخزن المؤقت الجاري في الخزان، قم بتحميل 5 ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول، وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من جل SDS-PAGE. املأ الآبار الفارغة ب LDS ، وقم بتشغيل الجل لمدة 90 إلى 120 دقيقة عند 120 فولت. أعد ترطيب غشاء النيتروسليلوز باستخدام عازلة نقل تحتوي على 20٪ ميثانول.

اشطف الجل والغشاء باستخدام المخزن المؤقت للنقل، وانشرهما برفق على مكدس التحضير. رتب الساندويتش المراد نقله بهذا الترتيب ، قطب سالب ، رغوة شطيرة ، ورق ترشيح ، جل SDS-PAGE مغسول ، غشاء النيتروسليلوز المغسول ، ورق الترشيح ، رغوة الساندويتش ، القطب الموجب. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة ، أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة.

قم بسد الغشاء الجاف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مخزن مؤقت حظر. احتضان الأغشية مع التخفيفات المناسبة للأجسام المضادة الأولية وبيتا أكتين في حجب العازلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. ثم أعط ثلاث غسلات من TBST لمدة 5 دقائق لكل منها.

احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف في مخزن مؤقت مانع لمدة 60 دقيقة، وكرر ثلاث غسلات من TBST. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. لتطوير الإشارات ، انشر المحلول المحضر عن طريق خلط كميات متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن على الغشاء ، قبل نقل لوحة التصوير إلى نظام التصوير للتصوير.