موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 5:25 دقيقة • April 28th, 2025
خذ محللة خلوية تحتوي على ناقل كلوريد البوتاسيوم 2، أو بروتينات KCC2، التي تنظم مستويات كلوريد الخلايا العصبية.
الفسفرة في المواقع التنظيمية تعطل وظيفة KCC2 ، مما يعدل النشاط العصبي.
أضف المحللة إلى الخرزات المترافقة مع الأجسام المضادة التي تستهدف KCC2 الفسفورية. احتضن للسماح بالارتباط ، ثم اغسلها لإزالة البروتينات غير المرتبطة والحطام الخلوي.
تعامل مع مخزن مؤقت متغير عند درجة حرارة عالية لإطلاق KCC2 ، ثم جهاز الطرد المركزي لفصل الخرز.
قم بتحميل المادة الطافية المحتوية على KCC2 على هلام الرحلان الكهربائي. افصل البروتينات إلى نطاقات لتأكيد وجود KCC2 الفسفوري.
انقل العصابات إلى غشاء ، ثم احتضن في محلول حجب لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.
احتضن بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف KCC2 الفسفوري.
اغسل ، ثم احتضن بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالإنزيم لتسمية الأجسام المضادة الأولية.
اغسل مرة أخرى ، ثم أضف ركيزة كيميائية ، والتي تتفاعل مع الإنزيم لإنتاج الضوء.
قياس شدة الضوء لتحديد KCC2 الفسفوري في المحللة.
piette 300 ميكرولتر من البروتين G sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 500 جم لمدة دقيقتين. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من PBS والدوامة جيدا. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي ، وكرر هذه الخطوة.
بعد ذلك ، امزج 1 ملليغرام
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية