وضع العلامات المناعية لبروتينات الغشاء العصبي في عينة مكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفئران

خذ عينة مكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفأر في مخزن مؤقت.

العينة مطلية بالبلاتين لتحسين تفاصيل السطح والكربون للاستقرار الهيكلي.

انقل العينة إلى قارورة بها عازلة هضم تحتوي على منظف.

احتضن لتسهيل انهيار الأنسجة، وترك الغشاء والبروتينات المضمنة في الطلاء.

اغسل بالمخزن المؤقت لإزالة الحطام.

أضف حلا حجب لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة الأولية الخاصة ببروتين الغشاء العصبي.

اغسل بمخزن مؤقت لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

احتضن بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالذهب والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

اغسل بالمخزن المؤقت لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.

اشطفه بالماء لمنع القطع الأثرية من بقايا الملح أثناء الفحص المجهري.

قم بتركيب العينة على مجهر إلكتروني ناقل الحركة أو شبكة TEM.

تحت TEM ، تصور بروتين الغشاء العصبي المستهدف الذي تحدده جزيئات الذهب ، والتي تظهر على شكل نقاط سوداء.

من أجل هضم SDS ، انقل نسخة طبق الأصل إلى قارورة زجاجية سعة 4 مليلتر مملوءة ب 1 مليلتر من المخزن المؤقت للهضم SDS. اتركه يهضم لمدة 18 ساعة عند 80 درجة مئوية مع الرج. لوضع العلامات المناعية ، اغسل النسخة المتماثلة لمدة 10 دقائق في مخزن مؤقت جديد لهضم SDS. ثم احتضنها بالأجسام المضادة الأولية والثانوية المخففة في 2٪ BSA TBS في غرفة رطبة عند 15 درجة مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة.

بعد ذلك ، قم بتركيب النسخة المتماثلة على شبكة شريطية متوازية مطلية بformvar مكونة من 100 سطر. قم بتصوير النسخة المتماثلة بمجهر إلكتروني ناقل الحركة عند 80 أو 100 كيلو فولت. ثم احصل على الصور الرقمية من خلال كاميرا CCD.