JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 2:34 د • April 28th, 2025
خذ شريحة حجرية مع ثقافة أحادية الطبقة من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران، أو RBMECs.
ترتبط الخلايا ببروتينات تقاطع ضيقة مرتبطة بالهيكل الخلوي للأكتين، تحاكي الطبقة البطانية للحاجز الدموي الدماغي.
استبدل الوسط بوسط خال من الجلوكوز غير المؤكسج، ثم ضع الشريحة في غرفة نقص الأكسجة.
عدم توفر الأكسجين والجلوكوز يمنع تخليق ATP. يتم تقسيم ATP المتبقي إلى مشتقات النيوكليوتيدات.
استنفاد ATP يعيق مضخات الكالسيوم ، مما يرفع الكالسيوم داخل الخلايا الذي ينشط إنزيمات أوكسيدودوكتاز.
بعد ذلك، قم بالتجديد بوسيط مؤكسج، ثم ضع الشريحة في حاضنة مؤكسجة. تستخدم الأوكسيدودكتازات المنشطة الأكسجين المعاد إدخاله لتحلل مشتقات النيوكليوتيدات ، مما يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS.
ROS يعطل التفاعلات بين بروتينات التوصيل الضيقة ويحث مسارات الإشارات التي تعيد تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين إلى ألياف الإجهاد ، مما يضعف تفاعلات الخلية بين
الخلية.الطبقة الأحادية ذات التفاعلات بين الخلايا المعطلة جاهزة للتحليل.
في التحضير ، قم بإعداد ومعايرة نظام زراعة خلايا نقص الأكسجة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب أن تكون بيئة الغرفة 95٪ نيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة الأكسجين من dmem الخالي من الجلوكوز عن طريق وضعه في غرفة نقص الأكسجة لمدة 4 إلى 6 ساعات. في وقت لاحق ، ابدأ في الضغط على الخلايا عن طريق استبدال وسيطها ب DMEM الخالي من الجلوكوز غير المؤكسج. ثم وضع الخلايا في غرفة نقص الأكسجة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، ضع الخلايا مرة أخرى على وسط كامل للخلية البطانية في دماغ الفئران. بعد ذلك ، أعد أكسجة الخلايا عن طريق إعادتها إلى الظروف الطبيعية لمدة ساعة.