الترسيب المناعي للكروماتين الأصلي لخلايا الغلاف العصبي

خذ خلايا الغلاف العصبي في مخزن مؤقت يحتوي على المنظفات والكالسيوم ومثبطات الإنزيم البروتيني.

يتخلل المنظف الخلايا ، بينما يقوم المثبط بتعطيل البروتياز للحفاظ على البروتين المستهدف المرتبط بالكروماتين.

أضف النوكلياز واحتضن. يستخدم النوكلياز الكالسيوم لهضم الكروماتين.

أضف المخزن المؤقت المحتوي على EDTA الذي يخلب الكالسيوم ، مما يؤدي إلى تعطيل النوكلياز.

أضف المخزن المؤقت للتحلل للخلايا ، وإطلاق الكروماتين.

جهاز الطرد المركزي وجمع المادة الطافية.

أضف الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف واحتضانها مع الدوران. جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.

أدخل حبات مغناطيسية تستهدف الجسم المضاد وتحتضن بالدوران.

أضف المخزن المؤقت للتحلل لفصل الحمض النووي غير المرتبط على وجه التحديد.

التقط الخرز مغناطيسيا وإزالة المادة الطافية.

أضف عازلة عالية الملح لفصل البروتينات غير المرتبطة على وجه التحديد.

التقط الخرز مغناطيسيا وإزالة المادة الطافية.

أضف عازلة تثبيت ، والتقط الخرزات مغناطيسيا ، وقم بإزالة الملوثات.

أعد تعليقه في محلول بروتيناز K لهضم البروتينات ، وإطلاق الحمض النووي.

بمجرد حصاد المجالات العصبية ، قم بعمل جهاز طرد مركزي 1 في 10 إلى 6 خلايا الغلاف العصبي لكل ترسيب مناعي عند 300 مرة جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بصب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الغلاف العصبي في مليلتر واحد من محلول الملح المتوازن. انقل المعلق إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ملزمة بالبروتين 1.5 مليلتر ثم أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.

Next, łполения поления поленитич тенияитления قم بسحب الخلايا على الفور لأعلى ولأسفل لمنع التكتل وتجنب تكوين أي فقاعات. ثم امزج 5 ميكرولترات من نوكلياز المكورات الدقيقة 0.1x و 145 ميكرولتر من محلول الهضم ، وأضف 5 ميكرولترات من نوكلياز المكورات الدقيقة المخففة لكل 1 في 1 في 10 إلى 6 خلايا. انقر فوق الأنبوب لخلط الأنبوب ووضعه في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة بالضبط.

هضم نوكلياز المكورات الدقيقة لتفتيت الكروماتين هو الخطوة الأكثر أهمية. يعد تجزئة الكروماتين المناسبة أمرا مهما لتحقيق دقة عالية ل ChIP. لضمان نجاح هذه الخطوة ، احتضان عينات متعددة واحدة تلو الأخرى لضمان عدم حدوث الهضم الزائد.

بعد 12 دقيقة، أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لإيقاف المكورات الدقيقة 10x لكل 1 مرات 10 إلى 6 خلايا. يجب حفظ العينات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا. يوضح تحليل المحلل الحيوي لعينة نوكلياز المكورات الدقيقة المهضومة أن معظم الحمض النووي قد تم تقسيمه إلى نيوكليوزومات أحادية وثنائية وثلاثية. بعد ذلك ، أضف 110 ميكرولتر من 2x RIPA buffer مكملا من 1 إلى 100 مع كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني لكل 1 في 1 في 10 إلى 6 خلايا.

انقر فوق الأنبوب للخلط ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية و 1,700 مرة g. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الكروماتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق عادي سعة 1.5 ملليلتر وضعها على الثلج. استخدم المخزن المؤقت RIPA المكمل بمثبطات البروتياز عند 1 إلى 1,000 لتخفيف الكروماتين بحيث يكون لكل IP حجم من 100 إلى 200 ميكرولتر. ثم قم بإزالة حصة تعادل 10٪ من وحدة تخزين ChIP كعينة إدخال.

قم بإعداد المدخلات بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE المكمل بالبروتيناز K واحتضانه عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد تنقية المدخلات باستخدام مجموعة تنقية PCR ، قم بقياس تركيز المدخلات باستخدام مقياس الطيف الضوئي للحجم الصغير. سجل النتائج في دفتر ملاحظات. أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغسول A و G لكل IP سيتم إجراؤه على كل عينة واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع دوران عند 20 دورة في الدقيقة.

ضع العينة على حامل مغناطيسي واترك الخرزات تنفصل. ثم انقل الحجم المطلوب إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل. أضف الجسم المضاد المطلوب إلى كل أنبوب ، ثم لف الأغطية بغشاء بارافين بلاستيكي لتجنب التبخر. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الدوران كما كان من قبل. في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب عند 2000 مرة جم لمدة 10 ثوان. ثم أضف 10 ميكرولترات من الخرز إلى كل IP واحتضن لمدة ثلاث ساعات عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة.

ثم ضع العينات على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية. ثم أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت RIPA مع مثبطات الإنزيم البروتيني لكل IP واحتضنه عند 4 درجات مئوية عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. بعد فترة الحضانة ، ضع العينات على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية. ثم أضف 150 ميكرولترا من محلول كلوريد الليثيوم المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني بتركيز منخفض لكل IP واحتضانه عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.

بعد فترة الحضانة، ضع العينات على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. ثم استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية. ثم أضف 150 ميكرولتر من TE البارد بدون مثبطات البروتياز إلى الخرز واحتضانها عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. بعد خطوة الغسيل النهائية ، أعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من محلول TE المكملة بالتركيز النهائي 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من البروتيناز K واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.