إجراء التهجين المزدوج في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في أقسام دماغ الفئران
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 4:06 د • April 28th, 2025
خذ قسما من دماغ الفأر الثابت كيميائيا.
أضف خليط تهجين يحتوي على عامل نفاذية ومجسات RNA المسمى FITC أو DIG.
احتضان للسماح بنفاذية الخلية ودخول المسبار.
ترتبط المجسات بالتسلسلات التكميلية على MBP mRNA ، وهي علامة مرجعية يتم التعبير عنها في كل مكان في الخلايا الدبقية قليلة التغصن ، أو ASPA mRNA ، الهدف.
اغسل لإزالة المجسات غير المقيدة.
أضف حاجزا مؤقتا لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
إدخال الأجسام المضادة المضادة ل FITC المترافقة ب HRP والتي تستهدف المسبار المسمى FITC.
اغسل ثم أضف FITC-tyramide.
يؤكسد HRP FITC-tyramide في شكل شديد التفاعل يرتبط بالبروتينات القريبة ، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة التألق.
اغسل وأعد إدخال المخزن المؤقت للحظر.
أضف الأجسام المضادة المضادة ل DIG المترافقة بالفوسفاتيز القلوية التي تستهدف المسبار المسمى DIG.
اغسل وقم بتطبيق محلول Fast Red.
يزيل الفوسفاتيز القلوي فسفريلات أحمر سريع ، مما ينتج عنه راسب فلورسنت.
تصور تحت المجهر الفلوري.
يشيرالتوطين المشترك لإشارات Mbp و ASPA إلى تعبير ASPA في الخلايا قليلة التغصن.
قمبتخفيف المجسين في المخزن المؤقت للتهجين ، وتسخينه مسبقا إلى 65 درجة مئوية ، واخلطه جيدا. ضع 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء مخبوز بالفرن. بعد ذلك ، احتضان الشرائح طوال الليل عند 65 درجة مئوية في غرفة رطبة.
في اليوم التالي ، انقل الشرائح إلى برطمان كوبلين يحتوي على مخزن غسيل مسخن مسبقا ، واغسل الشرائح لمدة 30 دقيقة ، مرتين عند 65 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل الشرائح لمدة 10 دقائق ثلاث مرات بمحلول غسيل MABT في درجة حرارة الغرفة.
في هذه الخطوة ، استخدم قلما مسعورا لرسم دوائر حول أقسام الأنسجة. بعد ذلك ، احتضن الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام المخزن المؤقت الذي يحجب ISH في غرفة رطبة. بعد ذلك ، احتضان الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية بجسم مضاد مضاد للفجل المقترن ببيروكسيداز الحار الحار
ثم ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على PBST. اغسلها في PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة ، واستبدلها ب PBST طازج في كل مرة. بعد ذلك ، أضف التيراميد الفلوري إلى الشرائح ، واتركها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الشرائح في برطمان كوبلين ، واغسلها في PBST لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.
بعد ذلك ، احتضان الشرائح باستخدام المخزن المؤقت الذي يحجب ISH لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية بجسم مضاد مضاد مضاد للفوسفاتيز القلوي المترافق مع DIG. بعد ذلك ، اغسلها باستخدام MABT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام 0.1 مولار Tris-HCL عند درجة الحموضة 8.2 لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بتصفية المحلول الأحمر السريع ، واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية بمحلول أحمر سريع في غرفة رطبة. نظرا لاختلاف وقت التطور الأمثل ، تحقق من الشرائح بانتظام باستخدام مجهر الفلورسنت لمراقبة تكوين الرواسب. ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في كل مرة.
نظرة عامة
تفصل هذه المقالة طريقة للكشف عن تعبير mRNA في الخلايا الدبقية قليلة التغصن باستخدام المجهر الفلوري. تتضمن التقنية تهجين مجسات RNA مع أهداف mRNA محددة، يتبع ذلك تضخيم الإشارة وتصورها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا الجزيئية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا الدبقية قليلة التغصن دوراً محورياً في الجهاز العصبي المركزي.
- يمكن أن يوفر فهم تعبير mRNA في هذه الخلايا رؤى حول الحالات العصبية.
- يسمح المجهر الفلوري بتصوير أهداف mRNA محددة.
- تعد تقنيات التهجين أساسية لدراسة التعبير الجيني.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة للكشف عن mRNA الخاص بـ ASPA في الخلايا الدبقية قليلة التغصن.
- تحسين تصور mRNA من خلال تضخيم الإشارة.
- إثبات التموضع المشترك لإشارات MBP و ASPA.
الطرق المستخدمة
- تحضير مقاطع من دماغ الفأر مثبتة كيميائياً.
- تطبيق خليط التهجين الذي يحتوي على مجسات RNA.
- استخدام محاليل الحجب لمنع الارتباط غير النوعي.
- استخدام المجهر الفلوري لتصوير تعبير mRNA.
النتائج الرئيسية
- الارتباط الناجح للمجسات بتسلسلات mRNA المستهدفة.
- تضخيم إشارات الفلورة من خلال التفاعلات الإنزيمية.
- أكد التموضع المشترك لإشارات MBP و ASPA تعبير ASPA.
- أثبتت الطريقة موثوقيتها في دراسة mRNA في الخلايا الدبقية قليلة التغصن.
الاستنتاجات
- تعد الطريقة المطورة فعالة للكشف عن mRNA محدد في أنسجة الدماغ.
- يعزز تضخيم إشارة الفلورة من قدرات التصوير المرئي.
- يمكن تطبيق هذه التقنية في دراسات إضافية حول وظيفة الخلايا الدبقية قليلة التغصن.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يتيح التهجين الموضعي المتألق المزدوج (FISH) رسم خرائط مكانية دقيقة للتعبير الجيني في مقاطع دماغ الفأر، مما يدعم الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف في عمليات البحث والتطوير المركزة على علم الأحياء العصبي. وتوفر قدرة هذه الطريقة على الكشف المشترك عن هدفين من الرنا (RNA) بحساسية عالية وضوحاً ميكانيكياً وثقة تنبؤية لاستجواب المسارات وتحليل التعبير الخاص بأنواع الخلايا. وتعد هذه القدرة ضرورية لتقليل المخاطر المرتبطة بالأهداف وتوجيه قرارات المحفظة البحثية في اكتشاف أدوية الجهاز العصبي المركزي (CNS).
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح التصوير المباشر للتعبير الجيني المشترك في مجموعات محددة من الخلايا العصبية.
- يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال تأكيد وجود RNA المستهدف في أنواع الخلايا ذات الصلة بالمرض.
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال تحليل التعبير الجيني المحدد مكانيًا.
- يوفر ثقة تنبؤية لنقل الأهداف إلى مسارات الفحص.
الفحص وتطوير المقايسة
- تأسيس مقاييس معتمدة قائمة على الأنسجة لتقييم المركبات في المراحل اللاحقة.
- توفير قراءات فلورية كمية وقابلة للتكرار لغرض توحيد المقاييس.
- تمكين تحليل دقيق للتوطين المشترك لدعم استراتيجيات الفرز المتعدد.
- تهيئة الأنظمة البيولوجية لسير عمل التصوير عالي المحتوى والقابل للتوسع.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يربط بيانات التعبير الجيني بالدوائر العصبية وأنواع الخلايا ذات الصلة بالمرض.
- يدعم تحديد المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال علم النسخ المكاني.
- يوفر الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري عن طريق ربط النتائج الجزيئية بسياق النسيج.
- يقلل من المخاطر الانتقالية من خلال تأكيد ارتباط الهدف في مناطق الدماغ ذات الصلة.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يُدمج بروتوكول التهجين الموضعي المتألق (FISH) المزدوج هذا ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، وذلك من خلال تمكين التحقق المدفوع بالفرضيات من التعبير الجيني في الموقع (in situ)، مما يوجه كلاً من عملية اختيار الأهداف واستراتيجيات المؤشرات الحيوية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تؤكد التعبير المكاني والتعبير الخاص بأنواع الخلايا للأهداف المرشحة في أنسجة الدماغ.
- الفحص: توفر بيانات فلورية كمية وقابلة للتكرار لتطوير المقايسات وتحسينها.
- التحليلات: توفر قياسات التوضع المشترك والكثافة لمقارنة التعبير الجيني عبر الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين الاكتشاف الجزيئي والتحقق على مستوى الأنسجة لمحاذاة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسة: تقدم منصة معيارية وقابلة للتكيف لتحليل التعبير الجيني المتعدد عبر برامج الجهاز العصبي المركزي (CNS).
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الهدف.
- القيمة التشغيلية: تقدم فحوصات قائمة على الأنسجة تكون معيارية وقابلة للتكرار والتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف وتخصيص رأس المال من خلال توضيح بيولوجيا الهدف في مرحلة مبكرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح ترتيب الأولويات المرتكز على تقييم المخاطر والدفع بتقدم أهداف ومؤشرات حيوية للجهاز العصبي المركزي (CNS).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الأنسجة، وتصميم المجسات، والمجهر الفلوري.
- يستلزم الوصول إلى بنية تحتية عالية الجودة للتصوير والتحليل الكمي.
- يتطلب توحيداً قياسياً بين الفرق في بروتوكولات وسم المجسات والكشف عنها.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع مختلفة من الأنسجة أو أهداف RNA.
- يجب تحسين خطوات تضخيم الإشارة لتحقيق التوازن بين الحساسية والنوعية.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تلطيخ المناعة للخلايا العصبية في شرائح دماغ الفأر بعد التهجين الموضعي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الجمع بين نقرا الإسفار في الموقع التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026