إجراء التهجين المزدوج في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في أقسام دماغ الفئران

خذ قسما من دماغ الفأر الثابت كيميائيا.

أضف خليط تهجين يحتوي على عامل نفاذية ومجسات RNA المسمى FITC أو DIG.

احتضان للسماح بنفاذية الخلية ودخول المسبار.

ترتبط المجسات بالتسلسلات التكميلية على MBP mRNA ، وهي علامة مرجعية يتم التعبير عنها في كل مكان في الخلايا الدبقية قليلة التغصن ، أو ASPA mRNA ، الهدف.

اغسل لإزالة المجسات غير المقيدة.

أضف حاجزا مؤقتا لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة المضادة ل FITC المترافقة ب HRP والتي تستهدف المسبار المسمى FITC.

اغسل ثم أضف FITC-tyramide.

يؤكسد HRP FITC-tyramide في شكل شديد التفاعل يرتبط بالبروتينات القريبة ، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة التألق.

اغسل وأعد إدخال المخزن المؤقت للحظر.

أضف الأجسام المضادة المضادة ل DIG المترافقة بالفوسفاتيز القلوية التي تستهدف المسبار المسمى DIG.

اغسل وقم بتطبيق محلول Fast Red.

يزيل الفوسفاتيز القلوي فسفريلات أحمر سريع ، مما ينتج عنه راسب فلورسنت.

تصور تحت المجهر الفلوري.

يشير

التوطين المشترك لإشارات Mbp و ASPA إلى تعبير ASPA في الخلايا قليلة التغصن.

قم

بتخفيف المجسين في المخزن المؤقت للتهجين ، وتسخينه مسبقا إلى 65 درجة مئوية ، واخلطه جيدا. ضع 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء مخبوز بالفرن. بعد ذلك ، احتضان الشرائح طوال الليل عند 65 درجة مئوية في غرفة رطبة.

في اليوم التالي ، انقل