$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
خذ أنسجة الأوعية الدموية الليفية المريضة المشتقة من المريض. يحتوي هذا النسيج على هياكل الأوعية الدموية الجديدة غير المنتظمة مع الخلايا البطانية والخلايا المحيطة.
عالج الأنسجة بمحلول مانع لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
احتضان بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف البروتينات السطحية على الخلايا البطانية والخلايا الحضوجية.
اشطفها بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، ثم احتضنها في المخزن المؤقت.
بعد الغسيل العازل ، احتضن الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالصبغة الفلورية للارتباط بالأجسام المضادة الأولية.
يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة الزائدة واحتضانه في العازلة.
بعد الغسيل العازل ، أضف صبغة نووية إلى تلطيخ نوى الخلايا. اشطفها بالماء العازل والماء منزوع الأيونات لإزالة الصبغة غير المربوطة.
انقل الأنسجة إلى شريحة مجهرية.
ضع وسائط التثبيت وختمها بغطاء يحتوي على وسائط تثبيت سريعة التصلب.
بعد التجفيف بالهواء ، قم بتخزين الشريحة على درجة حرارة منخفضة. بعد ذلك ، قم بتصوير الأنسجة تحت مجهر epifluorescence لتصور الترتيب المكاني للخلايا البطانية والخلايا العضوجية داخل هياكل الأوعية الدموية الجديدة.
قم بإمالة اللوحة على دعامة واحتضان القطرات في 500 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تحضير خليط الأجسام المضادة الأولية وفقا لبروتوكول النص.
ثم استخدم ملعقة مستديرة الحواف لنقل القطرات إلى صفيحة مستديرة القاع 96 بئر. احتضان القطرات في 30 ميكرولترا من خليط الأجسام المضادة الأولية لكل قطرة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل القطرات إلى طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على 2 مل من محلول الغسيل لكل بئر. اشطف القطرات بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق. ثم اغسل القطرات بتسع غسلات لمدة 30 دقيقة.
في اليوم التالي، اشطف القطرات ثلاث مرات باستخدام PBS. تحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المناسب وفقا لبروتوكول النص. انقل القطرات إلى صفيحة مستديرة القاع سعة 96 بئرا كما هو موضح سابقا. واحتضان اللوحة ب 30 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
بعد 4 ساعات، انقل القطرات إلى صفيحة 12 بئرا تحتوي على 2 ملليلتر من محلول الغسيل لكل بئر. أولا ، اشطف القطرات بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق. ثم اغسل القطرات بأربع غسلات لمدة 30 دقيقة.
في اليوم التالي، اشطف القطرات خمس مرات بمحلول الغسيل لمدة 30 دقيقة وثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 30 دقيقة. في اليوم التالي ، انقل القطرات إلى صفيحة مستديرة ذات 96 بئرا كما هو موضح سابقا. قم بإزالة بقع القطرات بصبغة Hoechst النووية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل القطرات إلى صفيحة سعة 12 بئرا تحتوي على 2 مل من PBS لكل بئر. واشطف ثلاث مرات باستخدام PBS.
بعد ذلك، ضع طبقة ضيقة من وسط التثبيت سريع التصلب على طول حواف زجاج الغطاء المربع. واتركه يجف لمدة دقيقة واحدة. ثم اشطف قطرة عن طريق غمسها في بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على ماء منزوع الأيونات. وانقل القطرة إلى شريحة مجهرية.
next, dis 15 microtle من وسيط التثبيت غير المتصلب المضاد للبهتان على القطرة. ضع زجاج الغطاء برفق فوق القطرة بحيث يكون وسيط التثبيت مواجها للشريحة. ودعها تستقر.
let the slides تجف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وتخزينها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. أخيرا ، قم بتصوير الشرائح باستخدام مجهر epifluorescence عمودي مزود بوظيفة التقسيم البصري عند هدف 20x أو 40x.