تلطيخ المناعة للخلايا العصبية في شرائح دماغ الفأر بعد التهجين الموضعي

Take شرائح دماغ الفأر الثابتة والمتنفذة التي تحتوي على الخلايا العصبية, بما في ذلك الخلايا العصبية اتروبين التي تعبر عن الكولين أسيتيل ترانسفيراز.

تخضع الشرائح لتهجين فلوري في الموقع للكشف عن mRNAs المستهدفة الموضعية في المحاور الكولينية ، مما ينتج عنه إشارات مضخمة باستخدام مجسات الفلورسنت ، والتي يتم اكتشافها باستخدام المجهر الفلوري.

أضف محلول حجب يحتوي على بروتينات وعامل تبريد. تمنع البروتينات الارتباط غير المحدد ، ويعمل عامل التبريد على تحييد المثبتات المتبقية.

احتضن بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف أسيتيل ترانسفيراز الكولين العصبي.

اغسل بمخزن مؤقت لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية المرتبطة بأسيتيل ترانسفيراز الكولين.

اغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة الزائدة، ثم اشطفه بالماء المقطر لإزالة بقايا العازلة.

قم بتركيب الشرائح بوسائط تثبيت تحتوي على بقعة نووية لتسمية النوى.

باستخدام الفحص المجهري الفلوري، قم بتصوير الشرائح لتصور إشارات mRNA المستهدفة والمحاور الكولينية الملطخة بأجسام مضادة محددة.

قم بتغطية كل شريحة ب 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول الحجب ، الذي يحتوي على ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر BSA ، و 100 مللي مولار جلايسين ، و 0.25٪ تريتون X-100 في PBS. قم بتغطية كل شريحة بالبارافيلم ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، عند 100 إلى 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة في محلول حجب للشرائح ، يتم استخدام جسم مضاد أسيتيل ترانسفيراز مضاد للكولين هنا. بعد التغطية ، تحتضن الشرائح مع البارافيلم لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. تأكد من عدم جفاف شرائح الدماغ. إذا لزم الأمر، أعد وضع محلول الأجسام المضادة المضادة ل chAT على شرائح الدماغ بعد 24 ساعة من الحضانة.

بعد غسل الشرائح ثلاث مرات في 1X PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق المناسب من Alexa إلى الشرائح. غطيها بالبارافيلم واحتضنها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء حمايتها من الضوء.

بعد انقضاء الساعة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في 1X PBS لمدة خمس دقائق لكل منها كما كان من قبل ، ثم اغسلها مرة واحدة بالماء المقطر. قم بتركيب الشرائح بوسيط تركيب يحتوي على DAPI. ثم تخيل شرائح الدماغ تحت المجهر الفلوري.