الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات تطبيق Flex Station 3 لدراسة الملف الدوائي لإمكانات المستقبل العابر أو رحلة قناة واحدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد الخلايا الأولى التي تعبر عن رحلة قناة واحدة في 96. حسنا لوحات microtiter.

بعد غسل الخلايا في غسالة صفيحة دقيقة ، يتم تحميل الخلايا بصبغة الفلورسنت الحساسة للكالسيوم. الأنفلونزا أوه 4:00 صباحا ، ثم تتبع فترة تحميل الخلية عدة غسلات إضافية. تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في تحضير اللوحة المركبة ، بما في ذلك رحلة ، ناهض واحد ورحلة مفترضة ، خصم واحد.

كخطوة أخيرة ، يتم إعداد معلمات البرنامج لقراءة اللوحة في نظام Flex Station 3. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر علاقات استجابة الجرعة للرحلة A تنشيط واحد بواسطة حمض الإنفلونزا الصوتي ، وتثبيط المركب المضاد A على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة ل 21 آلية تنشيط عن طريق قياس تدفق الكالسيوم. يمكن تطبيقه أيضا لدراسة وظائف قنوات العين الأخرى القابلة للنفاذية للكالسيوم والمستقبلات المقترنة بالبروتين العميق باستخدام الأصباغ المجمدة الحساسة للكالسيوم أو الأصباغ المحتملة.

الميزة الرئيسية لهذا التكتيك على الطرق الحالية مثل تصوير الكالسيوم ورسم خرائط التصحيح اليدوي هي أن تقنية توفير الوقت هذه توفر فحصا عالي الإنتاجية لوظيفة وتعديل صيغة الكالسيوم وقنوات الحديد ومستقبلات تعبئة الكالسيوم الأخرى. قبل بدء هذا البروتوكول ، تنمو خلايا HEC 2 93 بثبات مع الرحلة A واحدة بكثافة 70 إلى 90٪ كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء تحضير الخلية لمقايسة الكالسيوم ، قم بتغطية 96 لوحا جيدا عن طريق سحب 50 ميكرولترا من بولي لتر أورنيثين لكل بئر ، احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.

بعد الحضانة ، اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من KO بعد التربسين ، تنقل خلايا HEC 2 93 الكمية المطلوبة من الخلايا إلى أنبوب سفلي مخروطي معقم سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي. العينة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية الناتجة.

في وسط استزراع DMEM المكمل بمصل بقري الجنين المعطل بالحرارة بنسبة 10٪ ، يوزع مصل الأبقار الجنيني 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل بئر من لوحة البئر 96. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، اترك اللوحة في غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل وضعها في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة لمدة 20 إلى 44 ساعة. لتحضير فحص الكالسيوم ، قم أولا بإعداد المحاليل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بمجرد التحضير ، قم بخلط 10 ميكرولتر من إنفلونزا ملليمولار واحدة أوه 4:00 صباحا مع 10 ميكرولتر من الأونك. F1 27 ، انقل المحتوى بالكامل إلى خمسة ملليلتر من الأنفلونزا. أوه أربعة مخزن مؤقت للفحص مكمل ب 0.1٪ ألبومين مصل البقر.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا التي نمت في 96. ألواح الآبار مع HBSS عند 80 ميكرولتر لكل بئر مرتين باستخدام غسالة صفيحة دقيقة بعد الغسيل ، أضف محلول تحميل الأنفلونزا أوه 4:00 صباحا عند 50 ميكرولتر لكل بئر مع ماصة متعددة القنوات واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. خلال فترة تحميل الخلية لمدة ساعة واحدة ، قم بإعداد سلسلة من ثلاثة حلول x من ناهضات ، وسلسلة من ثلاثة حلول x من المضاد ، وحجم كبير من ناهض 300 ميكرومولار في الأنفلونزا أوه أربعة ماصة عازلة للفحص.

300 ميكرولتر من المحاليل المركبة المخففة في صفيحة مركبة 96 جيدا. رتب للحصول على التخفيف التسلسلي للمركب والضوابط الإيجابية والسلبية المقابلة في نفس العمود من اللوحة المركبة كلما أمكن ذلك. نظرا لأن محطة Flex الثالثة تقرأ عمودا واحدا في كل مرة ، فقم بعمل ماصة 300 ميكرولتر من محلول ناهض 300 ميكرومولار بجوار كل بئر يحتوي على المضاد كخطوة نهائية لتحضير الخلية.

اغسل الخلايا المحملة ثلاث مرات باستخدام العازل المقاوم للأنفلونزا أو أربعة حمض باستخدام غسالة الصفيحة الدقيقة بعد الغسيل الأخير. اترك 80 ميكرولترا من الأنفلونزا أوه أربعة عازلة حمض في كل بئر. لبدء قراءة اللوحة ، قم بتشغيل نظام Flex Station three وقم بإظهار برنامج soft max Pro 5.2.

احفظ التجربة باسم ملف جديد في الإعداد. اختر الوضع المرن وأدخل المعلمات لقياس تأثير ناهض ومضاد كما هو موضح في الإجراء المكتوب. بعد ذلك ، ضع صندوق تلميح جديد ، اللوحة المركبة ولوحة القراءة في الصواني المناسبة للمحطة المرنة. تلاتة.

ابدأ قراءة اللوحة بالنقر فوق زر القراءة في برنامج Soft Max Pro. ستقرأ المحطة المرنة الثالثة عمودا واحدا في كل مرة وتضيف مركبات في النقاط الزمنية المبرمجة مسبقا دون مقاطعة القراءة. بمجرد اكتمال التشغيل ، يمكن معالجة البيانات التجريبية مباشرة باستخدام برنامج Soft Max PRO أو نسخها ولصقها في أي برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel.

لتحليل البيانات ، قم بإنشاء منحنيات استجابة تركيز للرحلة ، وحمض صوتي مؤثر للإنفلونزا ، وللرحلة المفترضة مركب مضاد واحد باستخدام المربعات الصغرى المناسبة كما هو موضح في رحلة الإجراء المكتوبة. واحد هو تنشيط قناة كاتيونية نفاذة للكالسيوم يؤدي إلى تدفق الكالسيوم الذي يمكن اكتشافه بواسطة أنفلونزا صبغة حساسة للكالسيوم أوه 4:00 صباحا. تظهر الآثار التمثيلية للدورات الزمنية لتغيرات التألق استجابة لسلسلة من تركيزات حمض الإنفلونزا الصوتي أو FFA بتركيزات أعلى. يزداد التألق المستحضر FFA مع حركية أسرع بكثير من التركيزات المنخفضة على الرغم من مستويات التألق القصوى المماثلة.

لتمييز هذه الاختلافات ، تم إنشاء علاقة استجابة التركيز عن طريق قياس المعدلات الأولية لزيادة التألق. عند إضافة تركيزات مختلفة من FFA ، تم تحديد نصف الحد الأقصى للتركيز الفعال ل FFA ليكون 55.4 ميكرومولار. كما تظهر علاقة استجابة التركيز لتثبيط استجابة الكالسيوم التي أثارت FFA استجابة الكالسيوم من خلال رحلة مفترضة مركب مضاد واحد أ.

خفضت الجرعة بشكل مستقل استجابة خلية واحدة من الرحلة A إلى FFA بتركيز مثبط نصف أقصى يبلغ 4.3 ميكرومولار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة الملامح الدوائية للثلاثية A والقنوات ذات الصلة باستخدام محطة العلم ثلاثة.