الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح تطبيق Flex Station three لدراسة المقطع الدوائي لقناة مستقبل الجهد العابر أو trip a one. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير خلايا تعبر عن قنوات trip a one في أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً.

بعد غسل الخلايا في غسالة الأطباق الدقيقة، يتم تحميل الخلايا بالصبغة الفلورية الحساسة للكالسيوم Fluo-4. تتبع فترة تحميل الخلايا عدة عمليات غسل إضافية. الخطوة التالية من الإجراء هي تحضير طبق المركبات، بما في ذلك ناهض TRP1 ومضاد TRP1 مفترض.

كخطوة أخيرة، يتم ضبط معلمات البرنامج لقراءة الأطباق في نظام Flex Station three. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر علاقات الاستجابة للجرعة لتنشيط trip A one بواسطة flu phonemic acid، والتثبيط بواسطة المركب المضاد A. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول آليات تنشيط 21 من خلال قياس تدفق الكالسيوم، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا لدراسة وظائف قنوات أيونية أخرى نفاذة للكالسيوم ومستقبلات مقترنة بالبروتين G باستخدام صبغات فلورية حساسة للكالسيوم أو صبغات الجهد الغشائي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا التكتيك مقارنة بالطرق الحالية مثل تصوير الكالسيوم ورسم الخرائط اليدوي بالرقعة (patch mapping) في أن هذه التقنية الموفرة للوقت توفر فحصاً عالي الإنتاجية لوظيفة وتعديل قنوات الكالسيوم، وقنوات الحديد، وغيرها من المستقبلات المحفزة لتحريك الكالسيوم. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتنمية خلايا HEC 2 93 المنقولة جينياً بشكل مستقر بـ trip A one بكثافة تتراوح من 70 إلى 90% كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء تحضير الخلايا لمقايسة الكالسيوم، قم بطلاء أطباق ذات 96 بئراً عن طريق نقل 50 µL من poly L ornithine إلى كل بئر، ثم قم بحضن الأطباق عند 37 °C لمدة 15 دقيقة على الأقل.

بعد الحضن، اشطف الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) الخاص بـ KO. بعد استخدام التريبسين، انقل الكمية المطلوبة من خلايا HEC 2 93 إلى أنبوب معقم بقاع مخروطي سعة 15 milliliter ثم قم بطرد العينة مركزياً. تخلص من الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا الناتجة.

في وسط استنبات DMEM المدعم بنسبة 10% من مصل جنين البقر المثبط حرارياً، وزع 100 µL من معلق الخلايا في كل بئر من أطباق الـ 96 بئراً. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، اترك الطبق في غطاء التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل وضعه في حاضنة استنبات الخلايا الرطبة لمدة تتراوح من 20 إلى 44 ساعة. وللتحضير لمقايسة الكالسيوم، قم أولاً بتحضير المحاليل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بمجرد التحضير، اخلط 10 µL من 1 mM flu oh 4:00 AM مع 10 µL من onic. F1 27، ثم انقل المحتوى بالكامل إلى 5 mL من flu. Oh four assay buffer المضاف إليه 0.1% bovine serum albumin.

بعد ذلك، اغسل الخلايا النامية في أطباق 96-بئر باستخدام HBSS بمعدل 80 µL لكل بئر مرتين باستخدام غاسلة الأطباق الدقيقة، وبعد الغسل، أضف محلول تحميل fluo-4 بمعدل 50 µL لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات، ثم حضن الطبق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. وخلال فترة تحميل الخلايا التي تستغرق ساعة واحدة، قم بتحضير سلسلة من محاليل 3x للمنبهات، وسلسلة من محاليل 3x للمثبطات، وحجم كبير من المنبه بتركيز 300 µM في محلول منظم fluo-4 المختبري باستخدام الماصة.

أضف 300 µL من محاليل المركبات المخففة إلى طبق مركبات مكون من 96 بئرًا. احرص على ترتيب التخفيف التسلسلي للمركب وعناصر التحكم الإيجابية والسلبية المقابلة في نفس العمود من طبق المركبات كلما أمكن ذلك. وبما أن محطة Flex station three تقرأ عمودًا واحدًا في المرة الواحدة، فقم بنقل 300 µL من محلول المناهض (agonist) بتركيز 300 µM إلى البئر المجاور لكل بئر يحتوي على المضاد (antagonist) كخطوة نهائية لتحضير الخلايا.

اغسل الخلايا المُحمّلة ثلاث مرات باستخدام منظم pH الفلوريسنت (flu oh four acid buffer) باستخدام غسالة الأطباق الدقيقة بعد الغسلة الأخيرة. اترك 80 µL من منظم pH الفلوريسنت (flu oh four acid buffer) في كل بئر. لبدء قراءة الطبق، قم بتشغيل نظام Flex Station three وافتح برنامج soft max Pro 5.2.

احفظ التجربة باسم ملف جديد في مرحلة الإعداد. اختر الوضع المرن (flex mode) وأدخل المعلمات لقياس تأثير المحفز والمضاد كما هو موضح في الإجراء المكتوب. بعد ذلك، ضع صندوق رؤوس الماصات الجديد، ولوحة المركبات، ولوحة القراءة في الصواني المناسبة في محطة العمل المرنة (flex station). ثلاثاً.

ابدأ قراءة الطبق بالنقر على زر القراءة في برنامج Soft Max Pro. سيقوم جهاز Flex Station three بقراءة عمود واحد في كل مرة وإضافة المركبات في النقاط الزمنية المبرمجة مسبقاً دون مقاطعة عملية القراءة. وبمجرد اكتمال التشغيل، يمكن معالجة البيانات التجريبية مباشرةً باستخدام برنامج Soft Max PRO أو نسخها ولصقها في أي برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel.

لتحليل البيانات، قم بإنشاء منحنيات الاستجابة للتركيز لمركب trip, a one agonist flu phonemic acid، وللمركب المفترض trip a one antagonist compound a باستخدام ملاءمة المربعات الصغرى كما هو موضح في الإجراء المكتوب trip. A one هو قناة كاتيونية نفاذة للكالسيوم، يؤدي تنشيطها إلى تدفق الكالسيوم الذي يمكن اكتشافه بواسطة صبغة flu oh 4:00 AM الحساسة للكالسيوم. تظهر آثار ممثلة للمسارات الزمنية لتغيرات الفلورسنت استجابةً لسلسلة من تركيزات flu phonemic acid أو FFA عند التركيزات العالية. أحدث FFA زيادات في الفلورسنت بحركية أسرع بكثير مما هي عليه عند التركيزات المنخفضة، على الرغم من تماثل مستويات ذروة الفلورسنت.

للتمييز بين هذه الاختلافات، تم إنشاء علاقة الاستجابة للتركيز عن طريق قياس المعدلات الأولية لزيادة الفلورة. وعند إضافة تركيزات متفاوتة من FFA، تحدد التركيز الفعال النصفي الأقصى لـ FFA ليكون 55.4 micromolar. كما توضح العلاقة بين الاستجابة والتركيز لتثبيط استجابة الكالسيوم التي يحفزها FFA بواسطة مركب A، وهو مضاد مفترض لـ trip a one.

أدت الجرعة إلى تقليل استجابة خلايا trip A one لـ FFA بشكل مستقل، بتركيز تثبيطي نصفي قدره 4.3 micromolar. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة الملامح الفارماكولوجية لـ triple A one والقنوات ذات الصلة باستخدام flag station three.