تصوير عالي الدقة لمستقبلات الناقلات العصبية في نقاط الاشتباك العصبي في شبكية العين

خذ قسما لشبكية الفأر على شبكة المجهر الإلكتروني. يحتوي القسم على خلايا عقدية شبكية العين ، أو RGCs ، مرتبطة بشكل متشابك بالخلايا ثنائية القطب.

تحتوي الخلايا ثنائية القطب قبل المشبكي على حويصلات ناقل عصبي مرتبة في بنية شريطية بالقرب من الغشاء المشبكي.

تعرض RGCs بعد المشبكي مستقبلات الناقل العصبي العنقودية على غشاءها. يتم تصنيف هذه الخلايا بالوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B أو CTB.

يغسل بمخزن مؤقت للحفاظ على الرقم الهيدروجيني.

احتضان مع مخزن مؤقت محظور لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.

احتضان الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف مستقبلات الناقل العصبي و CTB.

يغسل بمخزن مؤقت لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة والحفاظ على درجة الحموضة.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع جزيئات الذهب النانوية ذات الأحجام المختلفة ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية ، ووضع علامات على الجزيئات المستهدفة.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، ثم جفف العينة بالهواء.

ضع المعادن الثقيلة التي تربط الجزيئات الكبيرة ، مما يعزز التباين.

باستخدام المجهر الإلكتروني ، حدد RGCs باستخدام CTBs المسمى وحدد موقع مستقبلات الناقل العصبي المسمى.

في هذه الخطوة ، قم بقص أقسام رقيقة للغاية بسمك 70 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق الصغر وجمعها على شبكات النيكل المطلية بالكربون من فورمفار. اغسل الشبكات بالماء المقطر مرة واحدة ، متبوعة بثلاث غسلات من TBS. بعد ذلك ، قم باحتضان الشبكات في 20 ميكرولترا من 5٪ BSA في TBS لمدة 30 دقيقة ، ثم في 20 ميكرولترا من خليط يحتوي على الماعز المضاد ل CTB وجسم مضاد لوحدة فرعية NMDAR واحدة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل الشبكات ثلاث مرات باستخدام 20 ميكرولترا من TBS في كل مرة عند درجة الحموضة 7.6. بعد ذلك ، اغسل الشبكات مرة واحدة باستخدام TBS عند درجة الحموضة 8.2 لمدة خمس دقائق. احتضان الشبكات لمدة ساعتين ب 20 ميكرولترا من خليط يحتوي على IgG مضاد للأرانب من الحمار ، إلى جانب جزيئات ذهب 10 نانومتر ، والحمار IgG المضاد للماعز مقترن بجزيئات ذهب 18 نانومتر.

بعد ساعتين، اغسل الشبكات في 20 ميكرولترا من TBS عند درجة الحموضة 7.6 ثلاث مرات، متبوعا بغسل في الماء فائق النقاء. ثم جفف الشبكات بالهواء. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشبكات بنسبة 5٪ من أسيتات اليورانيل في الماء المقطر لمدة ثماني دقائق ، متبوعا بنسبة 0.3٪ من سترات الرصاص في الماء المقطر لمدة خمس دقائق في الظلام.