المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط مستقبلات الرائحة في الخلايا المؤتلفة

ابدأ بصيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا ثدييات مؤتلفة ملتصقة في محلول تحفيز مكمل باللوسيفيرين، وهو ركيزة مضيئة.

احتضن للسماح بدخول لوسيفيرين إلى الخلية.

تعبر هذه الخلايا عن مستقبلات الرائحة المرتبطة بالغشاء إلى جانب بروتينات G الشمية وبروتينات نقل المستقبلات.

بالإضافة إلى ذلك، تعبر الخلايا عن بروتينات Glosensor السيتوبلازمية، والبروتينات المضيئة الحساسة ل AMP الدوري.

بدء قياس اللمعان.

ترتبط جزيئات الرائحة بمستقبلات الرائحة في الخلايا، مما يؤدي إلى تنشيط بروتين G المقترن وفصل الوحدة الفرعية α لبروتين G، أو Gα.

ترتبط الوحدة الفرعية Gα المنفصلة بإنزيم adenylate cyclase المضمن في الغشاء ، مما يؤدي إلى تنشيطه. يقوم الإنزيم المنشط بتحويل ATPs إلى AMPs دورية.

ترتبط AMPs الدورية هذه ببروتينات glosensor، مما يغير شكلها ويتيح ربط اللوسيفيرين.

ينتج عن هذا التفاعل تلألؤ، مما يؤكد تنشيط مستقبلات الرائحة.

أضف 75 ميكرولترا من محلول كاشف cAMP. قم بإزالة محلول التحفيز من الآبار وأضف 25 ميكرولترا من محلول كاشف المخفف المخفف إلى كل بئر. احتضن لوحة البئر 96 في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة وخالية من الروائح لمدة ساعتين.

أولا ، قم بتخفيف رائحة الأسيتوفينون إلى 1٪ في 10 مل من الزيت المعدني وقم بتغطية الأنبوب. قبل نهاية وقت حضانة كاشف cAMP ، أضف 25 ميكرولترا من محلول الرائحة إلى كل بئر في لوحة جديدة 96 بئر. ثم ضع لوحة الرائحة هذه في غرفة مقياس الإضاءة لمدة خمس دقائق لموازنة الغرفة بجزيئات الرائحة المتطايرة. اضبط مقياس الإضاءة لتسجيل اللمعان بدون ثانية من التأخير خلال 20 دورة من قياس اللوحة لمدة 90 ثانية ، مع 0.7 ثانية من الفاصل الزمني بين الدورات.

قبل قراءة اللوحة مباشرة ، قم بإزالة لوحة الرائحة من الغرفة. في صفيحة البئر 96 التي تحتوي على الخلايا المنقولة ، أضف 25 ميكرولترا من الرائحة في الفراغ بين الآبار ، ثم أعد اللوحة بسرعة إلى الغرفة. ابدأ قياس اللمعان لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة.