توطين التألق لبروتينات الوصلة الضيقة وألياف الإجهاد في الخلايا البطانية

خذ شريحة حجرية تحتوي على ثقافة أحادية الطبقة من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران، أو RBMECs، تحاكي طبقة الخلايا البطانية للحاجز الدموي الدماغي.

تظهر الخلايا بروتينات الوصلة الضيقة وألياف إجهاد الأكتين بسبب الإجهاد الناجم عن الحرمان من الأكسجين والجلوكوز متبوعا بإعادة الأكسجين.

قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا ، وقم بتطبيق مثبت للحفاظ على بنية الخلية ، ثم اغسل المثبت الزائد.

عالج بمنظف لاختراق الأغشية الخلوية.

احتضن باستخدام عامل حظر لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.

لتسمية بروتينات الوصلة الضيقة ، احتضن بأجسام مضادة أولية محددة ، ثم قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

احتضن مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور لتسمية الأجسام المضادة الأولية.

بدلا من ذلك، لتسمية ألياف الإجهاد، أضف الفالودين الموسوم بالفلوروفور.

Wash لإزالة جزيئات الملصقات غير المقيدة.

قم بإزالة الغرفة ، وقم بتطبيق وسيط تثبيت يحتوي على صبغة ملزمة للحمض النووي الفلوري على تلطيخ النوى ، ثم أغلقها بغطاء غطاء.

باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، تصور بروتينات التوصيل الضيقة المصنفة بالفلورسنت وألياف الإجهاد.

ابدأ بتعريض كل بئر من الطبقات الأحادية RBMEC إلى 100 إلى 200 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة Opti-MEM ، واستمر في حضانة لمدة ساعة. ثم اغسل شرائح الغرفة ثلاث مرات ، باستخدام 100 إلى 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر لكل غسلة. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS ، واحتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS كما كان من قبل.

الآن ، قم باختراق الخلايا عن طريق تطبيق 100 إلى 200 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 في PBS على كل بئر. واترك الطبق يحتضن لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. بعد أن يتم اختراق الخلايا ، ضع محلول الحظر. ودع هذا يعمل على الخلايا لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم إما بإجراء التألق المناعي لبروتين ZO-1 أو تسمية F-actin. لإجراء التألق المناعي للخلايا ل ZO-1 ، احتضنها بالجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في PBS ، كما هو الحال عند إزالة المثبت. ثم احتضان الخلايا في 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب FITC لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، لتسمية الخلايا بالرودامين فالويدين.

بعد تطبيق محلول الحجب لمدة ساعة ، قم بتعريض الخلايا ل 100 إلى 200 ميكرولتر من الرودامين فالودين في تخفيف من 1 إلى 50 ، مع 2٪ BSA PBS لمدة 20 دقيقة. بعد حضانة الجسم المضاد الثانوي أو الرودامين فالويدين ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات مرة أخرى كما كان من قبل. ثم قم بإزالة الغرف عن طريق تقشير الشريط المطاطي. تابع تركيب الشرائح باستخدام وسيط يحتوي على مضاد للتلاشي و DAPI. قم بتصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر في مستوى واحد بهدف 60x.