موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 4:15 دقيقة • April 28th, 2025
خذ شريحة حجرية تحتوي على ثقافة أحادية الطبقة من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران، أو RBMECs، تحاكي طبقة الخلايا البطانية للحاجز الدموي الدماغي.
تظهر الخلايا بروتينات الوصلة الضيقة وألياف إجهاد الأكتين بسبب الإجهاد الناجم عن الحرمان من الأكسجين والجلوكوز متبوعا بإعادة الأكسجين.
قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا ، وقم بتطبيق مثبت للحفاظ على بنية الخلية ، ثم اغسل المثبت الزائد.
عالج بمنظف لاختراق الأغشية الخلوية.
احتضن باستخدام عامل حظر لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.
لتسمية بروتينات الوصلة الضيقة ، احتضن بأجسام مضادة أولية محددة ، ثم قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
احتضن مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور لتسمية الأجسام المضادة الأولية.
بدلا من ذلك، لتسمية ألياف الإجهاد، أضف الفالودين الموسوم بالفلوروفور.
Wash لإزالة جزيئات الملصقات غير المقيدة.
قم بإزالة الغرفة ، وقم بتطبيق وسيط تثبيت يحتوي على صبغة ملزمة للحمض النووي الفلوري على تلطيخ النوى ، ثم أغلقها بغطاء غطاء.
باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، تصور بروتينات التوصيل الضيقة المصنفة بالفلورسنت وألياف الإجهاد.
ابدأ بتعريض كل بئر من الطبقات الأحادية RBMEC إلى 100 إلى 200 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة Opti-MEM ، واستمر في حضانة لمدة ساعة. ثم اغسل شرائح الغرفة ثلاث مرات ، باستخدام 100 إلى 200 م
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية