إجراء الكيمياء المناعية على أنسجة دماغ الرئيسيات غير البشرية

ابدأ بقسم دماغ الرئيسيات غير البشرية الثابت كيميائيا.

يربط البروتينات المثبتة القائمة على الألدهيد ، مما يحافظ على بنية الأنسجة ، ولكنه يترك بعض بقايا الألدهيد التفاعلية.

اغسل لإزالة طبقة الواقي من الفراغ بالتبريد المحيطة بقسم الأنسجة.

أضف عاملا مختزلا لتحييد مجموعات الألدهيد التفاعلية ، مما ينتج عنه منتجات ثانوية للتفاعل.

اغسل لإزالة هذه المنتجات الثانوية وعوامل التقليل الزائدة.

ضع محلول مانع لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتينا معبرا عنه في مواقع محددة على الغشاء العصبي.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أضف الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

تراكب بمجمعات أفيدين-بيوتين-بيروكسيداز التي ترتبط بالأجسام المضادة الثانوية.

يغسل مرة أخرى لإزالة المجمعات غير المرتبطة.

أدخل ركيزة كروموجينيك مع بيروكسيد الهيدروجين. في وجود بيروكسيد الهيدروجين ، يؤكسد إنزيم البيروكسيديز الركيزة ، مكونا رواسب بنية.

ابدأ بنقل أقسام بسمك 50 ميكرون من دماغ الرئيسيات غير البشري الثابت ، والتي تحتوي على منطقة الاهتمام إلى صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على PBS. اغسل الأقسام العائمة الحرة ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الأقسام في محلول بوروهيدريد الصوديوم الطازج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صخور بلطف بدون غطاء.

بمجرد انقضاء 30 دقيقة ، قم بشفط بوروهيدريد الصوديوم وأضف PBS إلى كل بئر. ضع الطبق على كرسي هزاز ورجه بقوة لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل مرتين أخريين ، أو حتى لا يتبقى أي من غاز التفاعل. قم بسد الأقسام عن طريق احتضانها في محلول من مصل عادي 2٪ و 0.5٪ جيلاتين سمك بارد ، مخفف في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.

بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، احتضن الأقسام ومحلول الأجسام المضادة الأولية مع هزاز لطيف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، بعد غسل الأقسام كما كان من قبل ، احتضان الأقسام في محلول الجسم المضاد الثانوي لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. بعد غسل الأقسام كما كان من قبل ، احتضن في أفيدين بيوتين بيروكسيداز ، أو محلول ABC ، لمدة ساعة واحدة مع الهزاز.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول جديد بنسبة 0.05٪ 3,3-diaminobenzidine مع 0.005٪ بيروكسيد الهيدروجين المخفف في TBS. بعد الغسيل ، احتضان الأقسام في محلول DAB لمدة ثلاث إلى سبع دقائق مع هزاز لطيف. بمجرد أن يتطور الراسب البني إلى اللون المطلوب ، أوقف التفاعل عن طريق الغسيل السريع مرتين في TBS البارد ، ثم من خلال سلسلة من غسلات TBS و PB الموقوتة.