تلطيخ الأنسجة الهيستوكيميائية المناعية للعمليات البردية للأنسجة الإكليلية للفئران للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

خذ شريحة تحتوي على الأقسام بالتبريد للأنسجة الإكلية للفئران الثابتة والمتنفذة.

حدد الخطوط العريضة للأقسام بقلم مسعور لخلق بيئة تلطيخ خاضعة للرسائر.

انقل الأقسام إلى غرفة الرطوبة لمنع جفاف الكواشف والأنسجة أثناء الخطوات اللاحقة.

عالج الأقسام ببروتينات المصل لمنع مواقع الارتباط غير المحددة.

اشطفه بمحلول عازل لإزالة بروتينات المصل الزائدة.

احتضان بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتينات معينة على الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة. ثم اشطفها بالماء المقطر المزدوج.

ضع وسائط تركيب مائية لحماية إشارة الفلورسنت ، ضع غطاء ، وإغلاقها.

قم بتصوير الأقسام تحت المجهر الفلوري لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ذات العلامات المناعية.

جفف حواف الشرائح ، وقم بعمل حدود طاردة للسائل حول حافة الشريحة باستخدام قلم عنق الرحم ، لضمان تغطية متساوية للسائل وتقليل تأثيرات الحافة. بعد ذلك ، قم بحظر الأقسام عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من المصل في PBS إلى كل شريحة. يجب أن يكون المصل من الأنواع التي يتم فيها رفع الجسم المضاد الثانوي. في هذه الحالة ، تم استخدام مصل الحمار.

تأكد من أن محلول الانسداد يمتد إلى حافة الشريحة ويغطي الأنسجة بالكامل لتجنب التلوين غير المتساوي. ضع الشرائح في غرفة الرطوبة لاحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية. تمييع الجسم المضاد IBA1 ، من 1 إلى 5,000 والجسم المضاد العصبي ، من 1 إلى 500 في خليط من مصل الحمار 1٪ في PBS.

قم بإزالة محلول الانسداد ، وأضف 300 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد ، الذي يحتوي على كلا الأجسام المضادة ذات الأهمية. ضع جميع الشرائح في غرفة الرطوبة ، واحتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها.

تحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ، عن طريق تخفيف كلاهما من 1 إلى 250 ، في مصل حمار 1٪ في PBS. أضف 300 ميكرولتر من الخليط على كل شريحة. وضع الشرائح في غرفة رطوبة خفيفة وضيقة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها. وأخيرا ، اشطفها بالماء المقطر المزدوج. احم الشرائح من الضوء أثناء الغسيل في PBS.

أضف بضع قطرات من وسط التركيب المائي ، مما يساعد في الحفاظ على شدة إشارة التألق لكل شريحة. ثم قم بتغطية الشريحة ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء متبقية باستخدام قضيب برأس قطني. لإغلاق وسائط التثبيت على الشرائح ومنع جفاف الأقسام ، قم بتغطية الحواف بطلاء الأظافر. تترك الشرائح لتجف بشكل مسطح لمدة ساعة واحدة في صندوق محمي بالضوء ، قبل تخزينها في حاوية خفيفة وضيقة ، ملفوفة بورق الألمنيوم عند 4 درجات مئوية.