Name: إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: تعلم عزل الحمض النووي الفيروسي عالي النقاء من النوى الكبسولية للفيروسات الغدية باستخدام الطرد المركزي فائق السرعة والاستخلاص بالفينول كلوروفورم. هذه الطريقة مثالية للتسلسل عالي الإنتاجية والتحويرات الجينية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب نقدر مساهمات سميث جريج ، بوميرانز ليزا ، ليمان مات ، إلدريدج مارليس ، Halina Goraczniak Staniszewska ، وأعضاء في مختبر Enquist هذا البروتوكول صقل.

1. اليوم الأول : العدوى الفيروسية وإعداد المخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق 10/05 (15 سم القطر) من خلايا الأنسجة للعدوى ، مثل خلايا PK - 15 لفيروس داء الكلب الكاذب (PRV) أو خلايا فيرو لفيروس الهربس البسيط (HSV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الخلايا هي 95 -- 100 ٪ متموجة ، تصيب منهم في (وزارة الداخلية) من 5-10. للقيام بذلك ، تطعيم كل لوحة باستخدام مخزون الفيروس في الحجم الكلي لل4 مل لكل لوحة ، ثم احتضان لوحات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. لوحات الروك بلطف كل 15 دقيقة للتأكد من أن الخلية لا يزال أحادي الطبقة المغلفة بالكامل لقيحة الفيروس. وفي الوقت نفسه ، على المديين المتوسط ​​الدافئة للخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ساعة واحدة من العدوى ، ونضح من اللقاح الفيروسي لوحات ، إضافة 15 مل من المتوسط ​​الدافئ ، واحتضان ل20/12 في 37 ساعة في حاضنة ترطيب درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخازن LCM (انظر الجدول رقم 1) والصخور بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لخلط دقيق. تحضير لإعادة تعليق TNE من الحمض النووي الفيروسي (انظر الجدول 2). </li></ol> 2. اليوم الثاني ، المرحلة 1 : تحلل الخلايا وتنبيذ فائق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد بصريا أن العدوى من الخلايا تسبب تأثير الاعتلال الخلوي موحدة (CPE). سماح العدوى إلى التقدم حتى جميع الخلايا واعتقلت ، ولكن لم ترفع قبالة لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط الخلايا المصابة في المتوسط ​​، والجمع بين الخلايا والمتوسطة في أنابيب مخروطية 50 مل. عدد من الأنابيب المخروطية اللازمة لهذه الخطوة ستعتمد على عدد من الأطباق المستخدمة للعدوى في الخطوة 1.2 أعلاه ، يمكن استخدام مثل أنبوب واحد مل 50 المخروطية لتكوير كحد أقصى من 3 أطباق من المتوسط ​​15 مل كل الاختياري : شطف لوحات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتتحد مع الخلايا والمتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا جهاز الطرد المركزي والمتوسطة لمدة 10 دقيقة في 2000 قوة centifugal النسبية (RCF) في درجة حرارة الغرفة ، ثم طاف ونضح resuspend كل بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني. إذا كان نشر بيليه من عدوى فيروسية في أنابيب مخروطية متعددة في الخطوة 2.2 ، يمكن معاد في أنبوب واحد هذه المخروطية في هذه الخطوة. كرر الطرد المركزي والتطلع الاختياري : قد تكون مخزنة في هذا بيليه -20 درجة مئوية وبروتوكول تابع في وقت لاحق. </li></ol> 3. اليوم الثاني ، المرحلة 2 : تنبيذ فائق الحفاظ على بيليه الخلية ومخازن LCM على الجليد كلما كان ذلك ممكنا خلال الخطوات التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى β - المركابتويثانول الجلسرين ٪ 0 -- LCM العازلة. تبدأ تبريد نابذة فائقة السرعة (على الخطوة 3.9 أدناه) عن طريق تحديد أن تصل إلى 4 درجة مئوية ، وتحول على فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية خلية في 5 مل من الجلسرين ٪ 0 -- LCM العازلة حتى أنه لم يعد clumpy. إذا لزم الأمر ، دوامة أنبوب لتفريق أي خلية غير منحل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج بإضافة 1.5 مل فريون (1،1،2 ثلاثي كلورو - 1 - ،2،2 trifluoroethane) وvortexing بقوة. أجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 10 دقيقة على 2000 إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة 4 درجة مئوية جمع الطبقة العليا مع طرف ماصة واسعة تحمل (تجنب واجهة) ونقل إلى أنبوب الاختياري الجديد : إذا كان بيليه هو الصلبة هلامي ، يمكنك بسرعة صب الطبقة العليا في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر استخراج غاز الفريون وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الطبقة العليا (~ 5 مل) ونقل إلى أنبوب polyallomer نابذة فائقة السرعة الجديدة. إضافة β - المركابتويثانول إلى الجلسرين المتبقيين -- مخازن LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرج في أنبوب الطرد المركزي التي polyallomer تحتها استخراج غاز الفريون (الطبقة العليا) مع 3 مل من الجلسرين 5 ٪ -- LCM (وسط طبقة) ، وتحتها ثم مرة أخرى مع 2.5 مل من الجلسرين 45 ٪ -- LCM (الطبقة السفلي). استخدام ماصة رقيقة لتجنب تجاوز محتويات الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر ، يعد أنبوب يعادل رصيد باستخدام نفس النسب من مخازن LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب نقل في دلاء نابذة فائقة السرعة. التوازن داخل الدلاء ل0.1 غرام من بعضها البعض ، عن طريق إضافة المزيد من الجلسرين بلطف 0 ٪ -- LCM العازلة إلى الطبقة العليا (~ 5-10 ميكروليتر في وقت واحد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة باستخدام الباردة مع الدوار دلو أفقي أو يتأرجح ، وتدور في عينات متوازنة لمدة 1 ساعة في إطار التعاون الإقليمي 77000 (25000 دورة في الدقيقة على سبيل المثال عن الدوار SW41Ti) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال تنبيذ فائق ، وجعل على ربط الحمض النووي لالتقاط الزجاج العائم على الايثانول خطوة هطول الأمطار (4.6 أدناه). كلا طرفي عقد من الماصة باستور الزجاج وتعليق القسم الأوسط أكثر من اللهب. عند قسم من الزجاج المصهور تقريبا ، وبرفق لتمتد على الزجاج ، وثنيه برفق لإنشاء ربط بإحكام الزاوية (&lt;90 درجة) ، وسحب بحدة ليغلق نهاية المطاف. إذا غيض من ربط الزجاج مفتوح ، عقد أكثر من طرف اللهب بحيث يذوب الزجاج بما فيه الكفاية لإغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تنبيذ فائق ، سترى رقيقة شفافة مع بيليه بقعة داكنة في الوسط. نضح بعناية السائل من أنبوب ، بما في ذلك المرق على طول الجانبين ، ولكن تجنب بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل TNE في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه ترك الجلوس لمدة لا تقل عن 10 دقيقة للسماح للترطيب بيليه. Optional : بيليه وربما أيضا في resuspend TNE بين عشية وضحاها ، إذا كان يحتفظ بها في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. اليوم الثالث : الأمطار "الشبح" DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق بيليه بواسطة pipetting مع طرف ماصة العيار الصغير (على سبيل المثال تلميح ماصة P200). لا تقلق بشأن القص في هذه الخطوة ، لأنه لا تزال تحتوي على الحمض النووي الفيروسي في capsids في هذه النقطة. إضافة الكواشف التالية إلى الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الفيروسية في درجة حرارة الغرفة ، لتدمير capsids : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.25 مل TNE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25 مل SDS 10 ٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ملغ بروتين K </li></ul> صخرة بلطف لمزج هذه الكواشف. يجب أن يكون هناك زيادة طفيفة في اللزوجة. </li></ol> حذار من القص من هنا فصاعدا ، مثل استخدام واسع يحمل ماصات ولا دوامة المواد الفيروسية <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البروتينات الفيروسية وذلك بإضافة 5 مل من الفينول كلوروفورم ، والبدء فورا في قلب vortexing أو للحفاظ على مستحلب. المزيج لمدة 10 ثانية ، ثم الطرد المركزي المستحلب لمدة 5 دقائق على 2000 إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة. جمع الطبقة العليا مع طرف ماصة واسعة تتحمل ، وتجنب واجهة ، ونقل إلى أنبوب جديد الاختياري : استخدام قفل المرحلة هلام (PLG) الأنابيب في هذه الخطوة لتجنب التلوث من واجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر استخراج الفينول كلوروفورم ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استخراج الفينول كلوروفورم الثانية ، جمع الطبقة العليا في أنبوب 30 مل Corex الزجاج والبرد في الأنبوب -20 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة ، مع الحرص على أن لا تجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من الايثانول الجليد الباردة ، وغطاء للأنبوب (على سبيل المثال عن طريق تمتد قطعة من M Parafilm فوق الجزء العلوي) ، وعكس لخلط فورا. يراقب عن الحمض النووي "شبح" لتظهر ، والتي تتكون من ترسيب لزج رقيقة. عكس الأنبوب بلطف لمزج وتسبب المزيد من الحمض النووي لزجة تترسب إلى المجموعة معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الزجاج هوك لالتقاط شبح الحمض النووي (ق). لطخة بعناية الحمض النووي لإزالة السائل الزائد ، ثم ضع هوك (نصيحة لأسفل) في أنبوب 1.5 مل ، والسماح ليجف. إضافة ،25-،5 مل من TE بحل شبح الحمض النووي. تسمح إعادة تعليق من الحمض النووي والمضي قدما على الأقل ساعة واحدة. الحمض النووي مخزن في 4 درجات مئوية. اختياري : لتعظيم العائد الحمض النووي ، وكسر الزجاج ورطتها في أنبوب مل 1.5 ، بحيث يمكن إعادة تعليق قبالة شظايا الزجاج يستمر مع مرور الوقت. </li></ol> 5. ممثل النتائج مع وزارة الداخلية عالية بما فيه الكفاية ، وينبغي أن الخلايا CPE تحقيق كامل في غضون 18 ساعة بعد الإصابة ~ (HPI) لسلالات PRV من النوع البري ، و~ 24 HPI للسلالات البرية HSV - 1 - نوع (الشكل 1). بمجرد أن يتم حصاد الخلايا المصابة بيليه ، لا يمكن للبروتوكول الخطوات المتبقية تكون كاملة في يوم واحد أو طويلة امتدت على مدى يومين (الشكل 2). عند إعداد السنانير الزجاج لالتقاط شبح الحمض النووي ، فمن المهم لجعل زاوية ربط يكون أقل من 90 درجة ، بحيث انه في وقت لاحق يمكن أن تندرج في قاعدة أنبوب مل 1.5 (الشكل 3). ختم هذا غيض من الخطاف يمنع فقدان الحمض النووي داخل الماصة. الحمض النووي شكل أشباح خلال هطول الأمطار والخطوة سوف تظهر المواضيع ، أبيض لزج (الشكل 4). هذه الكلية والعصا مع بعضها البعض و / أو ربط الزجاجية المستخدمة لالتقاط الحمض النووي. بالتالي يمكن استخدام الزجاج ربط نفسه لجمع ما يصل مواضيع متعددة من الحمض النووي من ضمن الحل هطول الأمطار. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اختيار العمود على أساس حجم المطلوب : </td><td> 10 مل </td><td> 15 مل </td><td> 20 مل </td><td> 40 مل </td></tr><tr><td> 1M بوكل </td><td> 1.3 مل </td><td> 1.9 مل </td><td> 2.5 مل </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 7.4) </td><td> 300 ميكرولتر </td><td> 450 ميكرولتر </td><td> 600 ميكرولتر </td><td> 1.2 مل </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ميكرولتر </td><td> 75 ميكرولتر </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 0.5 EDTA </td><td> 10 ميكرولتر </td><td> 15 ميكرولتر </td><td> 20 ميكرولتر </td><td> 40 ميكرولتر </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ميكرولتر </td><td> 75 ميكرولتر </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول (إضافة مباشرة قبل الاستعمال) </td><td> 4.3 ميكرولتر </td><td> 6.5 ميكرولتر </td><td> 8.6 ميكرولتر </td><td> 17.2 ميكرولتر </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> نسب استخدام الجلسرين في المئة عن المطلوب (0 ، 5 ، أو 45 ٪) </td></tr><tr><td> 0 ٪ الجلسرين </td><td> لا شيء </td><td> لا شيء </td><td> لا شيء </td><td> لا شيء </td></tr><tr><td> ماء </td><td> 8.3 مل </td><td> 12.5 مل </td><td> 16.7 مل </td><td> 33.4 مل </td></tr><tr><td> 5 ٪ الجلسرين </td><td> 0.5 مل </td><td> 0.8 مل </td><td> 1.0 مل </td><td> 2.0 مل </td></tr><tr><td> ماء </td><td> 7.8 مل </td><td> 11.7 مل </td><td> 15.7 مل </td><td> 31.4 مل </td></tr><tr><td> 45 ٪ زlycerol </td><td> 4.5 مل </td><td> 6.8 مل </td><td> 9.0 مل </td><td> 18.0 مل </td></tr><tr><td> ماء </td><td> 3.8 مل </td><td> 5.7 مل </td><td> 7.7 مل </td><td> 15.4 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 1. وصفات لإعداد مخازن LCM <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> لحجم 50 ملم </td></tr><tr><td> 5 مل كلوريد الصوديوم 1M </td></tr><tr><td> 2.5 مل 1M تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 </td></tr><tr><td> 1 مل 0،5 EDTA </td></tr><tr><td> 41.5 مل H 2 O </td></tr></tbody></table> الجدول 2. إعداد TNE (كلوريد الصوديوم 0.1 م و 50 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 و 10 ملي EDTA) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> لحجم 1 لتر </td></tr><tr><td> 0،2 ز بوكل </td></tr><tr><td> 0،2 ز KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 ز كلوريد الصوديوم </td></tr><tr><td> 1.15g نا 2 4 هبو </td></tr><tr><td> H 2 O ل1L </td></tr></tbody></table> الجدول 3. إعداد برنامج تلفزيوني (2.7 ملي بوكل ؛ 1.5 ملم KH 2 ص 4 ؛ 137 مم كلوريد الصوديوم ؛ 8.1 ملي نا 2 هبو (4) ؛ الرقم الهيدروجيني 7.0) <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. PK15 الخلايا (A) قبل الإصابة ، (B) في منتصف الطريق من خلال العدوى ، و (C) في تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) ، وبعد تعدد عالية من العدوى. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. نظرة عامة للبروتوكول. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. خطاطيف تستخدم نماذج تمثيلية ثلاثة من الزجاج لجمع أشباح الحمض النووي الفيروسي. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. سبيل المثال الممثل عن "الأشباح" بشكل جيد وفيرة الحمض النووي.

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وضعت أصلا أجزاء من هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الفيروسي في BSL4 الظروف ، لكنه يتكيف بشكل جيد على قدم المساواة لغير BSL شروطه. 4 ونحن عادة ما تستخدم هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي من PRV ألفا herpesviruses وHSV - 1 ، التي الجينوم الحمض النووي المغلقة في قفيصة البروتينية ومحاطة المغلف الدهون. 7،8 ومع ذلك فمن المرجح للتكيف مباشرة إلى غيره من فيروسات الحمض النووي كبيرة ، بما في ذلك بيتا وغاما وherpesviruses الفيروسات الغدية. ويشيع استخدام قلع مماثلة لل...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الفريون (1،1،2 ثلاثي كلورو - 1 - ،2،2 trifluoroethane) </td><td> الصياد </td><td> T178 - 4 </td><td> تحقق مع المؤسسة للحصول على المبادئ التوجيهية بشأن التخلص المناسب من النفايات المحتوية على غاز الفريون أو راجع منديز وآخرون. عن بدائل محتملة الفريون 9 </td></tr><tr><td> أنابيب المرحلة هلام قفل ، والقدرات 15ml الثقيلة </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> اختياري </td></tr><tr><td> أنابيب Polyallomer نابذة فائقة السرعة </td><td> بيكمان * </td><td> 331372 * </td><td> * حدد أنابيب ملائمة لنابذة فائقة السرعة الخاصة بك ، ويتم تضمين هذه كمثال فقط </td></tr><tr><td> NP - 40 / IGEPAL </td><td> سيغما </td><td> I - 3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK - 15 الخلايا </td><td> ATCC </td><td> CCL - 33 </td><td></td></tr><tr><td> خلايا فيرو </td><td> ATCC </td><td> CCL - 81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد الحمض النووي الفيروسي من nucleocapsids

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

الفيروسات هي طفيليات تلزم الخلوية ، وبالتالي فإن دراسة عينات من الحمض النووي الفيروسي يتطلب عزل المواد بعيدا عن الملوثات الخلية المضيفة والحمض النووي. تطبيقات المصب عدة تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الفيروسي النقي ، والتي يتم توفيرها من قبل هذا البروتوكول. وتشمل هذه التطبيقات تسلسل الجينوم الفيروسي ، حيث إزالة الحمض النووي المضيف أمر حاسم لتحسين بيانات الناتج عن تسلسل الفيروسي ، وإنتاج سلالات جديدة المؤتلف الفيروسية ، حيث شارك في 1،2 ترنسفكأيشن تنقيته من الحمض النووي الفيروسي البلازميد ويسهل إعادة التركيب الخطي. ، 3 هذا الإجراء يستخدم مزيجا من عمليات الاستخراج وكثافة المستندة الطرد المركزي لعزل الحمض النووي المنقى خطية هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. 4،5 الخطوات الأولية تهدف إلى تنقية عزل الفيروسية capsids المنقى ، والتي تحتوي على الحمض النووي الفيروسي حماية خلال عمليات الاستخراج والخطوات الطرد المركزي التي تعمل على إزالة البروتينات والحمض النووي الخلوي. تحلل من النشرات nucleocapsids ثم الحمض النووي الفيروسي ، واثنين النهائي الفينول كلوروفورم خطوات إزالة البروتينات المتبقية. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل يتركز عالية ونقية ، مع 260/280 OD 1.90 متوسط. اعتمادا على كمية من الخلايا المصابة المستخدمة ، غلة مجموعة الحمض النووي الفيروسي 150-800 ميكروغرام أو أكثر. نقاء من هذا الحمض النووي يجعلها مستقرة خلال التخزين الطويل الأجل في 4C. وبالتالي هذا الحمض النووي مناسبة بشكل مثالي لسرعة عالية التسلسل عالية الدقة تفاعلات PCR ، وtransfections. قبل بداية البروتوكول ، فمن المهم أن نعرف أن متوسط ​​عدد الخلايا في الطبق (على سبيل المثال ما معدله 8 × 10 خلايا PK - 15 6 متكدسة في صحن 15 سم) لاستخدامها ، وعيار من المخزون الفيروسي ( مثال 1 × 10 8 البلاك تشكيل وحدات لكل مل). هذه ضرورية لحساب تعدد المناسب للعدوى (وزارة الداخلية) للبروتوكول. 6 وعلى سبيل المثال ، لتصيب طبق واحد من 15 سم PK - 15 مع الخلايا الفيروسية الأسهم في أعلاه ، في وزارة الداخلية من 5 ، يمكنك استخدام ميكرولتر من 400 الأسهم الفيروسية وتمييع مع 3.6 مل من المتوسط ​​(إجمالي حجم تلقيح لمدة 4 مل صفيحة 15 سم). يمكن إعداد التحضيرات متعددة الحمض النووي الفيروسي في نفس الوقت. ويقتصر عدد التحضيرات في وقت واحد فقط من قبل عدد من الأنابيب التي عقدها الدوار نابذة فائقة السرعة (واحدة لكل فيروس ، انظر الخطوة 3.9 أدناه). نحن هنا وصف الإجراء كما لو يجري لأحد الفيروسات.

نحن تصف عملية عزل الحمض النووي عالية النقاء هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل هو تركيز عالية ونقاء ، مما يجعله مثاليا للالتسلسل عالية الإنتاجية ، وارتفاع الإخلاص تفاعلات PCR ، وtransfections لإنتاج recombinants الفيروسية الجديدة.

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

تُعد الفيروسات طفيليات خلوية إجبارية، ولذلك تتطلب دراسة الحمض النووي (DNA) الخاص بها عزل المواد الفيروسية بعيداً عن ملوثات الخلية المضيفة والحمض النووي الخاص بها. ...

يوضح هذا الفيديو إجراءً لعزل الحمض النووي DNA للقفيصة النووية الفيروسية بنقاوة عالية من الخلايا المصابة. أولاً، يتم تغيير طبيعة الأغشية الليبيدية باستخدام استخلاص مزدوج خالٍ من المواد المضافة. ثم يتم إجراء طرد مركزي فائق للعينة لترسيب القفيصات النووية الفيروسية وفصلها عن المكونات الخلوية والفيروسية الأخف وزناً.تُضاف المنظفات والبروتينيز K لتحرير الحمض النووي الفيروسي من القفيصات النووية المترسبة. بعد ذلك، يتم إجراء استخلاص مزدوج باستخدام الكلوروفورم والفينول لإزالة جميع البروتينات المتبقية. وأخيراً، يتم ترسيب الحمض النووي الفيروسي في المحلول.وفي نهاية المطاف، تُظهر النتائج أنه قد تم عزل الحمض النووي الفيروسي (viral DNA) بدرجة عالية من التركيز والنقاء من هذه الخلايا المصابة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية التي لا تتضمن استخلاصات حرة أو طرد مركزي فائق، في أن الحمض النووي الفيروسي الناتج هنا يحتوي على مستويات منخفضة جداً من التلوث بالحمض النووي للمضيف، مما يجعله مثالياً للإجراءات اللاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتسلسل العميق للجينومات الفيروسية. وقد استخدمنا هذه الطريقة لأول مرة في الأيام الأولى من العمل على الحمض النووي معاد التركيب عندما كانت التدابير الاحترازية الإضافية ذات أهمية قصوى.لقد طورنا هذا الإجراء لعزل الحمض النووي الفيروسي أثناء العمل في صندوق قفازات تحت ظروف المستوى الرابع من السلامة البيولوجية BSL four. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات تكوين التدرج وظهور طيف الحمض النووي (DNA ghosting) يصعب تعلمهما؛ وذلك لأن وضع طبقات التدرج يتطلب يداً ثابتة للغاية، كما أن طيف الحمض النووي الذي يترسب في المحلول قد يصعب رؤيته إذا لم تكن لديك خبرة سابقة في رصده.ابدأ هذا الإجراء بتجهيز خمس إلى 10 أطباق بقطر 15 سنتيمتر من خلايا الزرع النسيجي للإصابة. هنا، يتم تجهيز خلايا PK 15 للإصابة بفيروس pseudo rabies؛ وعندما تصل الخلايا إلى درجة تلاحم بنسبة 95 إلى 100%، استبدل الوسط بـ أربعة milliliters من الوسط المحتوي على الفيروس. وبمعدل إصابة MOI يتراوح من خمسة إلى 10، قم بحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة في حاضنة رطبة عند 37 degrees Celsius وبنسبة 5%CO2 مع التحريك كل 15 دقيقة.قم بهز الأطباق بلطف لضمان بقاء الطبقة الأحادية من الخلايا مغطاة بالكامل بلقاح الفيروس. وأثناء فترة التحضين، قم بتدفئة الوسط المستخدم في الخطوة التالية. وبعد مرور ساعة واحدة من العدوى، اسحب لقاح الفيروس من الأطباق.بعد ذلك، أضف 15 milliliters من الوسط الدافئ واحضن العينة عند 37 °C لمدة تتراوح من 12 إلى 20 ساعة في حاضنة رطبة. وأخيرًا، تمهيدًا لتجارب اليوم التالي، قم بتحضير دفعة جديدة من محاليل LCM وTNE المنظمة. لاحظ أن إضافة NP 40 ستؤدي إلى تكون شرائط في محلول acquis.ضع المحاليل المُحضرة على جهاز هزاز (rocker) عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وبحلول اليوم التالي، يجب أن تندمج المحاليل تماماً. في اليوم التالي، ضع الطبق على منصة مجهر مركب وتحقق بصرياً من أن عدوى الخلايا قد تسببت في تأثير اعتلال خلوي (cytopathic effect) منتظم.يجب أن تكون جميع الخلايا مستديرة، ولكن لا ينبغي أن تكون قد انفصلت عن الطبق. إذا لم تستدر الخلايا بعد، استمر في الحضانة حتى يتم ملاحظة التأثيرات المرضية الخلوية. بعد ذلك، اكشط الخلايا المصابة في الوسط، ثم اجمع الخلايا الموجودة في الوسط في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter لزيادة الإنتاجية.اغسل الأطباق باستخدام 10 milliliters من PBS واجمعها مع الخلايا الموجودة في الوسط، ثم قم بطرد الخلايا والوسط مركزياً لمدة 10 minutes بسرعة 2000 RCF في درجة حرارة الغرفة للتخلص من أي وسط متبقٍ، ثم اسحب المصل والطافي وأعد تعليق الراسب في 10 milliliters من PBS. كرر عملية الطرد المركزي والسحب. إذا لم يتم استكمال التجربة في اليوم نفسه، فقم بتخزين الراسب في درجة حرارة minus 20 degrees Celsius حتى يتم استخدامه في الخطوات الموضحة في هذا القسم.من المهم الحفاظ على كتل الخلايا والمحاليل المنظمة لـ LCM على الثلج قدر الإمكان. استعد لعملية الطرد المركزي الفائق بإضافة Beamer capto ethanol إلى محلول LCM المنظم الذي يحتوي على 0%glycerol بحيث يكون التركيز النهائي لـ Beamer capto ethanol هو 0.043%. كما يجب تجهيز جهاز الطرد المركزي الفائق بضبط درجة حرارته على أربعة درجات مئوية وتفعيل تفريغ الهواء (vacuum) أثناء تبريد الجهاز. أضف خمسة ملليلترات من محلول LCM المنظم الذي يحتوي على 0%glycerol و 0.043%Beamer capto ethanol إلى كتلة الخلايا، ثم استخدم الماصة للسحب والدفع لإعادة تعليق الكتلة.تأكد من تفتيت جميع التكتلات إذا لزم الأمر. استخدم جهاز الـ Vortex للأنبوب لتفتيت أي كتل خلوية غير ذائبة. بعد ذلك، لاستخلاص الأغشية الخلوية والفيروسية، أضف 1.5 milliliters.قم برج الفريون باستخدام جهاز الرج (vortex) بقوة على الفور. ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 2000 RCF عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد عملية الطرد المركزي، ستتكون طبقتان.تحتوي الطبقة العلوية المائية على النواة الفيروسية والقفيصة والبروتينات، بينما تحتوي طبقة الفريون السفلية على الأغشية الفيروسية والخلوية. باستخدام طرف ماصة واسع الفوهة، اجمع الطبقة العلوية مع تجنب الواجهة البينية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter جديد. من المهم تجنب ملامسة طبقة الفريون ونقل ذلك المذيب العضوي إلى الطبقة المائية في الأنبوب الجديد.أضف الفريون وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس كما سبق لتكرار استخلاص الفريون بعد عملية الطرد المركزي. اجمع الطبقة العليا بما يقرب من five milliliters وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي فائق من البولي أمير جديد. أضف beamr capto ethanol بنسبة 0.043% إلى مخازن glycerol LCM buffers الاثنين المتبقيين.بعد ذلك، ولتحضير تدرج في أنبوب الطرد المركزي البوليمري، استخدم ماصة رفيعة لوضع 3 milliliters من LCM بتركيز 5%glycerol أسفل مستخلص الفريون. ثم ضع أسفل ذلك 2.5 milliliters من LCM بتركيز 45%glycerol. كذلك، وعند الحاجة، قم بتحضير أنبوب موازنة مكافئ باستخدام نفس نسب محاليل LCM المنظمة.ضع الأنابيب في سلال جهاز الطرد المركزي الفائق ووازنها بحيث لا يتجاوز الفرق بينها 0.1 grams، وذلك عن طريق إضافة كميات إضافية من 0%glycerol LCM buffer إلى الطبقة العلوية بلطف، بمعدل 50 إلى 100 µL في المرة الواحدة. قم بتدوير العينات الموزونة لمدة ساعة واحدة بسرعة 77,000 RCF عند درجة حرارة 4 °C أثناء عملية الطرد المركزي الفائق. استخدم ماصة زجاجية لصنع خطاف لالتقاط الـ DNA الطافي عند خطوة الترسيب بالإيثانول.أمسك كلا طرفي الماصة وعلق الجزء الأوسط فوق اللهب. وعندما يسخن جزء من الزجاج، اسحبه برفق لتمديده. ثم قم بثنيه برفق لتشكيل خطاف بزاوية حادة تقل عن 90 درجة، واسحبه بقوة لإغلاق الطرف.إذا كانت طرف الخطاف الزجاجي مفتوحة، فقم بتثبيت الطرف فوق اللهب بحيث ينصهر الزجاج بما يكفي لإغلاقها. بعد عملية الطرد المركزي الفائق، ستتكون كريّة رقيقة معتمة بها بقعة داكنة في المنتصف، والتي تحتوي على القفيصات النووية الفيروسية. قم بشفط السائل من الأنبوب بعناية، بما في ذلك القطرات الموجودة على الجوانب، مع تجنب الكريّة الموجودة في قاع الأنبوب.أضف 0.5 milliliters من TNE في درجة حرارة الغرفة. اترك الراسب لمدة 10 minutes على الأقل للسماح بترطيب الراسب. إذا لن يتم استكمال الإجراء حتى اليوم التالي، ضع الراسب المعاد تعليقه في درجة حرارة أربع degrees Celsius.باستخدام طرف ماصة P 200، قم بتفتيت الراسب المميّه عن طريق السحب والدفع بالماصة. لا تقلق بشأن تكسر الحمض النووي في هذه الخطوة لأن الحمض النووي الفيروسي لا يزال محاطاً بالقفيصات في هذه المرحلة. لفتح القفيصات، أضف ما يلي إلى الراسب الفيروسي في درجة حرارة الغرفة: 4.25 milliliters من TNE، و 0.25 milliliters من 10%SDS، و two milligrams من البروتين EK.قم بالرج بلطف لمزج هذه الكواشف. من المفترض أن تحدث زيادة طفيفة في اللزوجة الآن بعد تدمير القفيصات، ويجب توخي الحذر لتجنب تكسير الـ DNA؛ لذا استخدم ماصات ذات فتحة واسعة ولا تستخدم جهاز الفورتيكس (vortex) للمادة الفيروسية لاستخلاص البروتينات الفيروسية.انقل العينة إلى أنبوب هلام قفل الطور (phase lock gel tube) وأضف خمسة مليلتر من الفينول كلوروفورم. ابدأ فوراً بالقلب للحفاظ على مزيج مستحلب عن طريق القلب لمدة 10 ثوانٍ على الأقل. بعد ذلك، قم بطرد المستحلب مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 2000 RCF في درجة حرارة الغرفة.بعد عملية الطرد المركزي، خذ الطبقة العليا وانقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على هلام فصل الأطوار (phase lock gel tube). كرر عملية الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى بعد الاستخلاص الثاني. اجمع الطبقة العليا في أنبوب زجاجي من نوع coex سعة 30 milliliter وبّرد الأنبوب عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius لمدة تتراوح من 10 إلى 15 minutes.مع الحرص على عدم تجميده. أضف 10 milliliters من الإيثانول البارد. أغلق الأنبوب واقلبه للمزج.راقب فوراً ظهور "شبح الحمض النووي" (DNA ghost)، والذي يتكون من راسب خيطي رفيع. اقلب الأنبوب بلطف لمزيد من الخلط ولجعل رواسب DNA اللزجة تتجمع معاً. أخيراً، استخدم خطافاً زجاجياً لاستخراج أشباح DNA بعناية، ثم جفف الـ DNA عن طريق التربيت عليه بمنديل Kim wipe لإزالة السائل الزائد.بعد ذلك، ضع طرف الخطاف لأسفل في أنبوب سعة 1.5 milliliter. ولزيادة حصيلة DNA إلى أقصى حد، اكسر الخطاف الزجاجي داخل أنبوب الـ 1.5 milliliter بحيث يمكن أن يستمر تعليق الشظايا الزجاجية بمرور الوقت. اتركها لتجف، ثم أضف من 0.25 إلى 0.5 milliliters من te لإذابة DNA ghost.اترك عملية إعادة تعليق DNA تستمر لمدة ساعة واحدة على الأقل، ثم احفظ DNA عند درجة حرارة 4 °C. تم تحضير DNA الفيروسي من القفيصات النووية (nucleo capsids) كما هو موضح في هذا المقال المرئي؛ يظهر هنا مثال تمثيلي لـ DNA ghost جيد التكوين ووفير، يتكون من DNA جينومي فيروسي خطي مرسب في المحلول. تتجمع السلاسل معاً وستتطلب وقتاً لإعادة الترطيب بمجرد وضعها في محلول Acquia. تم تشغيل DNA فيروسي محضر من سلالات PRV، وهي Becker Bartha وأربع سلالات إضافية، لمدة ساعة واحدة على هلام agarose بنسبة 0.5% وتم صبغها باستخدام ethidium bromide.تستخدم كل عينة من PRV مقدار 1 µL من مستحضر القفيصة النووية للحمض النووي الفيروسي، بإجمالي حجم 250 µL على اليسار. يوضح سلم الحمض النووي لـ lambda bacteria phage، سواء كان مهضومًا أو غير مهضوم، الحجم الكبير للحمض النووي لـ lambda غير المهضوم البالغ 48.5 kb، والحمض النووي الجينومي لـ PRV الذي يبلغ حوالي 140 kb.بعد ذلك، توضح سلسلة تخفيف بكميات معروفة من Lambda DNA أن تركيز عينات PRV الموجودة على اليمين يتراوح من 50 إلى 200 nanograms per microliter بإجمالي إنتاجية تتراوح من 12 إلى 50 micrograms لكل تحضير من DNA الفيروسي. تم هضم عينات DNA الفيروسي المحضرة من أربع سلالات من PRV طوال الليل باستخدام إما BAM H one أو KPN one. وفُصلت عينات DNA المهضومة بواسطة إنزيمات القطع عن طريق الرحلان الكهربائي طوال الليل على هلام agarose بتركيز 0.8% وصُبغت بـ ethidium bromide.تتضمن مسارات H one ثمانية ميكروغرام من الحمض النووي DNA للنواة القفيصية الفيروسية، بينما تتضمن مسارات KPN one أربعة ميكروغرام من الحمض النووي الفيروسي DNA. يمكن تمييز سلالات PRV المختلفة من خلال أنماط تعدد أشكال طول شظايا التقييد الخاصة بكل منها. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التسلسل العميق من أجل الحصول على بيانات حول محتوى الجينوم الفيروسي بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات لتوصيف الحمض النووي الفيروسي DNA عن طريق تعدد أشكال طول شظايا التقييد أو R fps، وبصمة ساوثرن (southern blotting)، واستنساخ الحمض النووي DNA المؤتلف، وبناء الفيروسات، وغيرها من عمليات معالجة فيروسات الهربس وأنواع أخرى من الفيروسات.لا تنسَ أن العمل مع fon قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood)، أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد عملية الترسيب، يمكن لطبقة fon أن تتحول بسرعة من حالة شبه صلبة هلامية إلى حالة سائلة، لذا يجب تقييم كل أنبوب بشكل فردي قبل تحديد ما إذا كان الصب أو السحب بالماصة هو الطريق الأفضل لجمع الطبقة المائية العلوية.

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

وهناك طريقة بسيطة وفعالة وقوية لتزامن وصول عناصر فيروسية متعددة لخلايا النبات عن...

بسيطة وقوية في الجسم الحي و في المختبر مدخل لدراسة الجمعية فيروس

علم الجينوم فيروس واحد (SVG) هو وسيلة لعزل وتضخيم الجينوم من virons واحد. يتم تصنيف معلقات الفيروسية من تجمع مختلط باستخدام التدفق الخلوي على شريحة المجهر مع آبار منفصلة تحتوي على الاغاروز، وبالتالي الاستيلاء على الفيريون والحد من قص الجينوم أثناء التجهيز النهائي. ويتم تحقيق كامل الجينوم التضخيم متعددة باستخدام التضخيم التشرد (MDA) مما أدى إلى المواد الجينية التي هي مناسبة لتسلسل.

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام &#39;جينوم فيروس واحد&#39;

في هذا الفيديو ، نصف إجراء لإجراء حقن نانوي لفيروس الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة ذبابة الفاكهة الذكور البالغين ، ثم ندرس الاستجابات المضادة للفيروسات التي بدأت بسبب العدوى. يحدد تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل التنظيم الإضافي لجينات معينة في الذباب المصاب الذي يشير إلى تنشيط مسارات الاستجابة المناعية بما في ذلك تداخل الحمض النووي الريبي وإشارات JAK / STAT.

حقن النانو الفيروسي داخل الصدر لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف في الذباب البالغ

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإنشاء كروموسوم اصطناعي بكتيري معدي يحتوي على (كدنا) كامل الطول للحمض النووي الريبي الجيني الموجب لفيروس التهاب الدماغ الياباني. يمكن استخدام هذا البروتوكول لبناء (كدنا) وظيفي لفيروسات الحمض النووي الريبي الإيجابية الأخرى ، مما يجعله أداة جينومية قوية لدراسة بيولوجيا الفيروسات.

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

نقدم استراتيجية جديدة لعزل مقصورات التكاثر الفيروسي (RC) عن الخلايا البشرية المصابة بالفيروس الغدي (Ad). يمثل هذا النهج نظاما خاليا من الخلايا يمكن أن يساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عنه بالإضافة إلى تنظيم التفاعلات الفيروسية والمضيف التي تم إنشاؤها في RC.

العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

تفكيك نوى فيروس الأنفلونزا A أثناء دخول الفيروس إلى الخلايا المضيفة هي عملية متعددة الخطوات. نصف طريقة في المختبر لتحليل المراحل المبكرة من الطلاء الفيروسي. في هذا النهج ، يتم استخدام الطرد المركزي لتدرج السرعة لتشريح الخطوات التي تبدأ في فك الطلاء كيميائيا حيويا في ظل ظروف محددة.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.

التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتسلسل الحمض النووي الريبي غير المتحيز للعينات الفيروسية من العزلات السريرية البشرية.

تسلسل عميق متحيز من الحمض النووي الريبي الفيروسات من العينات السريرية

والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

وهنا يقدم نهجاً جديداً للتعرف على الفيروسات النباتية مع مورثات الحمض النووي المزدوج-حبلا. نحن نستخدم الطرق القياسية لاستخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأوراق المصابة وإجراء تسلسل الجيل القادم. أدوات Bioinformatic تجميع تسلسل في كونتيجس، وتحديد كونتيجس يمثلون جينوم الفيروس وتعيين الجينوم للمجموعات التصنيفية.

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

للتحليل الميكانيكي المتعمق للفيروس التزامني التنفسي (RSV) تخليق الحمض النووي الريبي ، نبلغ عن بروتوكول لاستخدام فوسفوبروتين الفوسفورتين المرافق (P) للكوادر الخالية من الحمض النووي الريبي (N0)للتجميع المختبري اللاحق للنيوكليوكابسيدات الخاصة بالفيروس (NCs).

توليد وتجميع النوى الخاصة بالفيروسات من الفيروسات المتزامنة التنفسية

تعلم عزل الحمض النووي الفيروسي عالي النقاء من النوى الكبسولية للفيروسات الغدية باستخدام الطرد المركزي فائق السرعة والاستخلاص بالفينول كلوروفورم. هذه الطريقة مثالية للتسلسل عالي الإنتاجية والتحويرات الجينية.

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

استكشف المزيد من الفيديوهات