إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير ركيزة منقوشة ثنائية الأبعاد للتحكم في امتصاص البروتين ونمو الخلايا. يتم تحقيق ذلك باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية لتصنيع سيد منقوش ، والذي يستخدم لإنتاج ختم A-P-D-M-S للطباعة الدقيقة. كخطوة ثانية ، يتم تحضير الركيزة الذهبية المزخرفة ، والتي تتضمن طباعة التلامس الدقيق لإنتاج نمط مع المناطق التي تمتص البروتين وتقاومه.

بعد ذلك ، تتم إضافة البروتين والخلايا إلى الركيزة من أجل تصور النمط والدراسة. يتم الحصول على نتائج النمو الخلوي والسلوك التي تظهر حصرا جيدا للبروتين والخلايا على ركائز النمط هذه بناء على الفحص المجهري الفلوري وتباين الوجه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل طباعة MicroCon للبروتينات ، هي أن طبقة أحادية الجليكول المنتهية تقاوم البروتين غير المحدد وامتصاص الخلايا في خلفية النمط.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب تحسين تقنية الختم المناسبة لكل نمط مطبوع. لبدء إعداد المركز الرئيسي المزخرف ، رقاقة السيليكون على مبرمج الدوران ، وخلال الخطوة الأولى من برنامج الدوران الثنائي ، اشطف الرقاقة بالأسيتون. خلال الخطوة الثانية من برنامج الدوران ، سوف يتبخر الأسيتون تاركا رقاقة نظيفة وجافة في بداية الدوران ، ويطبق مقاومة للضوء على الرقاقة ثم يدور الطبقة باستخدام الظروف الموضحة سابقا.

اخبز الرقاقة المطلية بمقاومة للصور على حرارة 110 درجة مئوية لمدة دقيقتين باستخدام لوح تسخين عالي التوحيد. نمط الصورة التالية. رقاقة مطلية مقاومة للصور باستخدام نظام محاذاة القناع وقناع مناسب.

أولا ، ضع الركيزة على شاحنة التفريغ الخاصة بمحاذاة القناع. ثم أدخل القناع في صينية الحامل وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية لتثبيت القناع في مكانه للتأكد من الاتصال الجيد بين القناع والركيزة. ارفع الركيزة حتى تلتقي بالقناع.

استخدم بصريات التقويم للتأكد من إجراء اتصال جيد. أخيرا ، قم بتشغيل المصباح لتعريض الركيزة للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع الطباعة الحجرية. قم بتطوير الرقاقة المزخرفة في المطور لمدة دقيقة واحدة و 45 ثانية مع تحريك لطيف.

اشطفها جيدا بدرجة أشباه الموصلات ، والماء منزوع الأيونات ، وجففها بتيار من تطوير نمط فحص غاز النيتروجين باستخدام مجهر مزود بمرشح للأشعة فوق البنفسجية. ابدأ هذا الإجراء بإعداد مقوي راتنج 10 إلى واحد بالوزن. خليط السيجار 180 2 تماما.

قم بتغطية الرقاقة المزخرفة بالصور بالخليط في طبق بتري يمكن التخلص منه في فراغ تجفيف ديغا ، سيد PDMS المغطى حتى لا تظهر فقاعات. بعد التأكد من أن السيد في قاع الطبق ، اترك الختم يجف في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. عندما يتم معالجة ختم PDMS ، قم بقص الختم من الرئيسي وقم بقصه إلى الحجم المناسب.

قم بتخزين الختم في حاوية مغطاة بحيث يكون جانب مميزا لأعلى لحمايته من الغبار والحطام. لتحضير الركائز لترسيب المعدن ، قم أولا بمعالجة زلات الغطاء الزجاجي المستدير ببلازما الأكسجين لمدة 10 دقائق. ثم اشطف زلات الغطاء مرتين بالماء منزوع الأيونات ، وتجفيفه بتيار غاز النيتروجين بين الشطف بعد الشطف بالماء ، واشطفه مرتين بالإيثانول مرة أخرى ، وتجففه بتيار غاز النيتروجين بين الشطف.

باستخدام نظام ترسيب شعاع الإلكترون الجيب المتعدد ، قم بإيداع 50 أنغستروم من التيتانيوم متبوعا ب 150 أنجستروم ذهب. لا تقم بثني المبخر بين ترسيب طبقة التيتانيوم والطبقة الذهبية. اشطف ختم PDMS بالإيثانول وجففه جيدا.

باستخدام غاز النيتروجين ، ضع محلول الختم على الختم بالتنقيط حتى يغطى بالكامل. جفف الختم جيدا بغاز النيتروجين. تعتمد طباعة التلامس الجزئي لملف HEXA Decane على ميزات ختم PDMS وهي واحدة من أصعب جوانب هذا الإجراء.

يتطلب الختم الناجح تطوير تقنية جيدة تطبق ضغطا متساويا. أثناء الختم. للطباعة التقليدية ذات التلامس الدقيق في الهواء ، اضغط برفق على الختم على الركيزة الذهبية واترك الطبقة الأحادية تتشكل لمدة 15 ثانية.

بدلا من ذلك ، بالنسبة للأنماط المكونة من ميزات صغيرة جدا ونسب عرض إلى ارتفاع عالية ، ضع الركيزة الذهبية في طبق بتري يحتوي على 18.2 ميجا ماء منزوع الأيونات ، مما يضمن غمر الركيزة. ثم اضغط برفق على الختم على الركيزة الذهبية واترك طبقة أحادية اللون تتشكل لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، اشطف الركيزة المختومة مرتين بتجفيف الإيثانول بغاز النيتروجين.

بعد كل شطف ، ضع الركيزة في طبق بتري وقم بتغطية الركيزة بمحلول التعبئة الخلفية. أغلق الطبق ببرام لمنع التبخر. اسمح للطبقة الأحادية للخلفية بالتشكل في الظلام لمدة 12 إلى 14 ساعة.

أخيرا ، قم بإزالة زلة الغطاء المزخرفة من محلول الملء الخلفي واشطفها مرتين بتجفيف الإيثانول بغاز النيتروجين بعد كل شطف. لتطبيق البروتين على زلة الغطاء المزخرفة ، ضع زلة الغطاء إما في طبق بتري صغير أو غرفة زراعة الخلايا قم بتغطيتها ب 500 ميكرولتر إلى مليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بفوسفات ديلكوس. يجب أن يغطي DPBS الركيزة بالكامل أثناء حضانة البروتين.

لضمان تغطية متساوية للبروتين ، أضف محلولا مركزا من البروتين إلى DPBS واخلط المحلول عن طريق سحب العينات عدة مرات. احتضان خليط البروتين مع الركيزة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، اشطف الركيزة جيدا باستخدام DPBS لإزالة البروتين غير المرتبط ، مع الحرص على عدم تجفيف الركيزة أو إحضارها عبر واجهة ماء الهواء.

بعد ثلاث مرات شطف ، استنشق DPBS. ثم أضف ما يقرب من 500 ميكرولتر من وسائط نمو الخلايا الكاملة للحفاظ على ركيزة رطبة. استبدل وسائط النمو المستخدمة لشطف الركيزة.

مع الوسائط الجديدة ، أصبحت الركيزة جاهزة الآن للطلاء بالخلايا. عادة ما يتم طلاء 30 إلى 200 خلية لكل ملليمتر مربع على الركيزة. تظهر هذه الصورة طابع A-P-D-M-S مرئيا تحت المجهر عن طريق وضع جانب ميزة الختم لأسفل على زلة غطاء زجاجي ، وشريط المقياس هو 100 ميكرومتر.

ينتج عن الختم الصحيح نمط بروتين حاد وواضح يمكن تصوره من خلال تطبيق بروتين مسمى بالفلورسنت مثل LOR 6 47 المسمى فيبرونكتين. يظهر هنا حبس خلايا chk one في نمط البروتين. يبلغ حجم أشرطة المقياس 100 ميكرومتر في هذه الصور.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتصور نمط البروتين بعد تثبيت SU. هنا ، يتم استخدام ثلاثة أجسام مضادة مضادة للصفائح مترافقة 50 LOR لتصور صفائح منقوشة مصنفة بخلايا عصبية الحصين الفأرية E 18 الموضحة في أربعة أيام في المختبر E 18 تظهر الخلايا العصبية الحصينية للفأر الملطخة بجهاز تعقب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا الأحمر خمسة 80 أن نمو الخلايا يقتصر بشكل جيد على نمط البروتين. في حين أن هذه التقنية يمكن إتقانها بسهولة ، فقد تنشأ العديد من المشكلات الشائعة كما يتضح من مستحضرات الركيزة النمطية هذه التي يتصورها امتصاص الفبرونيكتين المترافق LOR 6 47.

يمكن أن يؤدي تطبيق البروتين دون خلط كاف لمحلول البروتين المركز في DPBS إلى أنماط بروتين غير متساوية. يمكن أن يؤدي الختم غير الصحيح إلى نقل النمط الجزئي أو انهيار الطابع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تعريض ركيزة النمط التي تحتوي على البروتين الممتص للهواء إلى تعطيل الطبقة الأحادية مما يتسبب في انخفاض المقاومة.

في الخلفية ، يمكن أن تنتج الزخرفة المغمورة أنماطا ذات ميزات صغيرة يصعب طباعتها عن طريق الطباعة التقليدية ذات التلامس الصغير والهواء. تظهر هاتان الصورتان مناطق مختلفة من نفس النمط مطبوعة بنفس طابع PDMS في الهواء أو تظهر خطوط دعم المياه منزوعة الأيونات في الصورة على اليسار لإثبات أن الميزات الصغيرة للنمط فقط هي التي فشلت في الطباعة بنجاح. أشرطة المقياس 20 ميكرومتر بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 18 إلى 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع ركيزة نمط. إنتاج ختم A-P-D-M-S. استخدم طباعة التلامس الدقيقة لإعداد ركيزة ذهبية بنمط وتصور هذا النمط باستخدام البروتين والخلايا.