الجيل مسخي في كبسولة الخصية
نوفمبر 7, 2011
الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) لديها القدرة على التعامل مع عدد لا يحصى من الأمراض المختلفة. فائدة هذه الخلايا تكمن في حقيقة أنها يمكن أن تفرق في أي نوع من الخلايا في الجسم. نحن هنا وصف فحص مسخي، والذي يستخدم للتدليل على pluripotence من hPSCs.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم تعدد القدرات من خلال تكوين أورام مسخية في محفظة خصية الفئران التي تعاني من نقص المناعة باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أو H PSCs. ابدأ بحصاد مستنبت من H PSCs المفترضة التي سيتم اختبار تعدد قدراتها. ثم قم بإجراء عملية جراحية للكشف عن خصيتي الفأر وحقن الخلايا في محفظة الخصية.
أعد الخصيتين إلى موضعهما الأصلي وأغلق الفتحة الجراحية للفأر، وبعد ستة إلى 12 أسابيع، افحص الورم الناتج عن طريق التشريح النسيجي للتحقق من وجود خلايا من كل طبقة جرثومية. وفي النهاية، يمكن للنتائج أن تثبت أن خط HPSC متعدد القدرات حقاً من خلال إظهار قدرته على التمايز إلى خلايا من الطبقات الجرثومية الثلاث جميعاً في فأر يعاني من نقص المناعة. وعلى الرغم من الإبلاغ مؤخراً عن طرق جديدة لإثبات تعدد قدرات الخلايا الجذعية البشرية، إلا أن اختبار الورم المسخي يظل المعيار الذهبي في هذا المجال، وسيقوم ترون، وهو فني أول في مختبري، باستعراض الإجراء.
يتم جعل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة تآلف، ثم يتم تفكيك هذه الخلايا باستخدام Accutase، ثم تُعد الخلايا لإعادة تعليق 1 مليون من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لكل عملية حقن. أولاً، تُحلق منطقة البطن للفئران الذكور المخدّرة التي يبلغ عمرها ستة أسابيع من سلالة فئران تعاني من نقص المناعة باستخدام ماكينة حلاقة. يتم تنظيف الجدار الأمامي لبطن الفأر باستخدام محلول بوفيدون يود، بدءاً من مركز البطن والتحرك في اتجاه عقارب الساعة نحو الخارج.
ثم اغسل المنطقة المحلوقة بـ 70%ethanol. كرر هذه العملية ثلاث مرات، مع تغيير المسحات في كل مرة. ولإجراء العملية الجراحية، انقل الحيوان إلى وسادة تدفئة داخل غطاء معقم باستخدام مقص جراحي معقم.
أجرِ شقاً طولياً بطول واحد سنتيمتر عبر الجلد والبريتون أسفل مستوى مفصل الورك مباشرةً مع تثبيت البريتون باستخدام ملقط. ثم استخدم زوجاً آخر من الملاقط المعقمة للوصول إلى الورك الأيمن وسحب الأنسجة الدهنية البيضاء مع الخصيتين المرتبطتين بها. الآن، املأ حقنة توبيركولين سعة 1 CC بـ hpsc المراد حقنها. احقن ببطء من 20 إلى 30 ميكروليتر من H PSCs في مركز كبسولة الخصية بعيداً عن أي أوعية دموية رئيسية.
اسحب الإبرة ببطء باستخدام الملقط لتجنب ارتداد الخلايا. أعد الخصيتين والأنسجة الدهنية إلى موضعهما الأصلي في التجويف البطني. أغلق الصفاق باستخدام غرزتين أو ثلاث غرز قابلة للامتصاص، ثم أغلق الجلد باستخدام المشابك الذاتية.
بعد الجراحة، يتم إعطاء المسكنات مرتين يومياً حسب الحاجة. توضع الحيوانات تحت المراقبة لرصد أي نمو ملموس للورم على مدار ستة إلى 12 أسبوعاً. وعندما يصل حجم الورم إلى خمسة مليمتر تقريباً، يتم استئصال الورم من الفأر المضحى به لأغراض التوثيق.
قم بتصوير الورم وقياس كل من الحجم والوزن. ثم قطّع الورم إلى قطع صغيرة وثبّتها في محلول 4%paraldehyde لإجراء الفحص النسيجي المرضي. عادةً، يتم ملاحظة الورم المسخي بعد ستة إلى 12 أسبوعاً.
في هذا المثال، تم حقن مليون خلية جذعية بشرية متعددة القدرات من خط WA 09 في غلالة الخصية لفأر منقوص المناعة. ويكشف الفحص الدقيق للورم المسخي عن وجود تباين وعديد من الكيسات الملتصقة، كما هو متوقع.
تشير التحاليل النسيجية المرضية إلى وجود خلايا من كل طبقة من الطبقات الجرثومية الثلاث. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تضمين خط خلوي كعنصر تحكم إيجابي معلوم القوة لضمان إتمام المقايسة بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحديد ما إذا كان خط الخلايا الجذعية البشرية متعدد القدرات أم لا.
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة اختبار المسخ (teratoma assay)، وهو طريقة تُستخدم لتقييم تعدد القدرات للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يتضمن هذا الاختبار حقن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في محفظة الخصية لفئران تعاني من نقص المناعة، وفحص الأورام المسخية الناتجة للتأكد من تمايزها إلى أنواع خلوية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
- علم الأمراض النسيجي
خلفية علمية
- يمكن للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أن تتمايز إلى أي نوع من الخلايا.
- يعد تكوين الورم المسخي مؤشراً رئيسياً على تعدد القدرات.
- يعتبر هذا الفحص المعيار الذهبي لإثبات تعدد القدرات.
- توجد طرق جديدة، ولكن لا يزال فحص الورم المسخي مستخدماً على نطاق واسع.
الغرض من الدراسة
- إثبات تعدد القدرات للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) من خلال تكوين الورم المسخي.
- تقديم منهجية مفصلة لإجراء مقايسة الورم المسخي.
- تسليط الضوء على أهمية استخدام ضابط موجب في المقايسة.
الطرق المستخدمة
- حصاد الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) والتحضير للحقن.
- الكشف الجراحي عن خصية الفأر وحقن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs).
- مراقبة نمو الورم على مدار ستة إلى اثني عشر أسبوعاً.
- التحليل النسيجي للورم المسخي (teratoma) لتحديد تمايز الطبقات الجرثومية.
النتائج الرئيسية
- تكونت الأورام المسخية بعد ستة إلى اثني عشر أسبوعاً من الحقن.
- أكد التحليل النسيجي المرضي وجود خلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث.
- أثبتت التجربة فعالية مقايسة الورم المسخي في تقييم تعدد القدرات.
- تضمنت التجربة ضابطاً موجباً للتحقق من صحة نتائج المقايسة.
الاستنتاجات
- يُعد اختبار الورم المسخي طريقة موثوقة للتأكد من تعدد القدرات للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs).
- تعتبر التقنيات الجراحية السليمة والمراقبة أمرًا بالغ الأهمية لتحقيق نتائج ناجحة.
- قد تستكشف الدراسات المستقبلية طرقًا بديلة جنبًا إلى جنب مع الاختبارات التقليدية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يوفر مقايسة الورم المسخي قراءة وظيفية لتعدد القدرات من خلال إثبات القدرة على التمايز عبر جميع الطبقات الجرثومية الثلاث داخل الجسم الحي. وتدعم هذه المقايسة التحقق من الأهداف والحد من المخاطر الميكانيكية في التطوير المبكر للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. كما تتيح ثقة تنبؤية في الهوية الخلوية قبل الانتقال إلى النماذج قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يؤكد تعدد القدرات عن طريق التحقق من التمايز إلى سلالات الأديم الظاهر، والأديم المتوسط، والأديم الباطن.
- القيمة التشغيلية: يستخدم نموذجاً قياسياً داخل الجسم الحي لتقليل ادعاءات تعدد القدرات الإيجابية الكاذبة.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف بشأن مدى ملاءمة خط الخلايا الجذعية للتطوير العلاجي.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد مخرجات نسيجية مرضية كمية لتمثيل الطبقات الجرثومية.
- القيمة التشغيلية: وضع بروتوكول قابل للتكرار باستخدام حقن محفظة الخصية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة.
- القيمة الاستراتيجية: دعم توحيد المقايسات عبر المختبرات لضمان اتساق اختبارات تعدد القدرات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: التحقق من القدرة التطويرية للخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من البشر (hPSCs) قبل تمايزها إلى أسلاف محددة السلالة.
- القيمة التشغيلية: تتطلب المراقبة على مدار 6–12 أسبوعاً لرصد تكوّن الأورام وإجراء التحليل النسيجي المرضي.
- القيمة الاستراتيجية: توجيه التقدم المدروس للمخاطر لخطوط الخلايا الجذعية نحو دراسات الفعالية قبل السريرية.
تكامل المسار وسير العمل
يعمل مقايسة الورم المسخي كخطوة تدقيق في سلسلة اكتشاف الخلايا الجذعية، حيث تأتي هذه الخطوة بعد مرحلة الحفاظ على تعدد القدرات وقبل مرحلة التمايز الموجه أو اختبارات الفعالية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يختبر الفرضية الأساسية للتعددية القدراتية من خلال تقييم القدرة على التمايز إلى الأنسجة الثلاثة.
- الفحص: ينتج معدلات تكوين مسخية معيارية وتقييماً نسيجياً لتقييم السلالات بشكل مقارن.
- التحليلات: يقدم قراءات محددة لطبقات الجنين عبر علم الأمراض النسيجي لتحديد كمية إمكانات التمايز.
- البحث الانتقالي: يربط بين تأكيد التعددية القدراتية وسير عمل التمايز اللاحق لإنتاج خلايا ذات صلة بالأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يعمل كنقطة تفتيش قابلة لإعادة الاستخدام للتعددية القدراتية لسلالات متعددة من hPSC في فحص مسارات العلاج.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في تحديد هوية الخلايا الجذعية من خلال تأكيد تعدد القدرات الوظيفي.
- القيمة التشغيلية: يقدم نتائج معيارية وقابلة للتكرار من خلال إجراءات جراحية وهستولوجية محددة.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن كفاءة رأس المال عن طريق استبعاد الخطوط غير متعددة القدرات في مرحلة مبكرة من التطوير.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد الأولويات القائمة على المخاطر لخطوط الخلايا الجذعية من أجل الاستثمار في التمايز ونمذجة الأمراض.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في جراحة القوارض والتقنيات التعقيمية لحقن محفظة الخصية.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى سلالات فئران تعاني من نقص المناعة ومرافق المتابعة بعد الجراحة.
- يستلزم وجود بنية تحتية لعلم الأنسجة المرضي لتحديد الطبقات الجرثومية في مقاطع الورم المسخي.
- يتضمن إشرافاً أخلاقياً وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) لاستخدام الحيوانات في فحوصات القدرة على تكوين الأورام.
- يتقيد بالجدول الزمني الذي يتراوح بين 6–12 أسبوعاً، مما قد يؤدي إلى إبطاء حملات الفرز التكرارية.
