فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

تسمح لنا حاسة الشم بالكشف عن المواد الكيميائية المتطايرة في البيئة الخارجية والتعرف عليها. ترتبط هذه المواد بمستقبلات في نهاية العصبونات الحسية الشمية وتنشط سلسلة من عمليات نقل الإشارة التي تؤدي إلى فتح قنوات البوابة ذات النيوكليوتيدات الحلقية، تليها قنوات الكلوريد المنشطة بالكالسيوم. الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تنشيط هذه القنوات مباشرة عن طريق الضوء باستخدام المركبات المتقنّة، والمركبات المتقنّة هي جزيئات تم جعلها غير نشطة فسيولوجياً بواسطة "قفص" كيميائي.

تؤدي ومضة من الأشعة فوق البنفسجية إلى كسر القفص وتحرير المركبات النشطة فسيولوجياً المحبوسة. يتم تضمين Cycl أو mp أو الكالسيوم المقفص (cage calcium) في المحلول داخل الخلوي، حيث يملأ ماصة الرقعة (patch pipette) وينتشر إلى السيتوبلازم في الخلايا العصبية الحسية الشمية. يتم تطبيق ومضة فائقة على منطقة Cary لتحرير cycling أو MP أو الكالسيوم، بينما تُجرى تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) لقياس التيار في وضعية تثبيت جهد الخلية الكاملة.

أهلاً بكم. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) مدمجة مع سياسات FE لمركبات القفص. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة القنوات التي يتم التحكم فيها بواسطة cMP وقنوات الكولين المنشطة بالكالسيوم في العصبونات الحسية الشمية. لذا، لنبدأ.

يتضمن نظام تسجيل تثبيت الرقعة المستخدم هنا مجهراً مقلوباً، ونظام تروية، ومتحكماً دقيقاً، وقطباً للتسجيل، وقطباً مرجعياً متصلاً بمرحلة الرأس لمضخم تثبيت الرقعة، وجميعها مثبتة على طاولة مضادة للاهتزاز داخل قفص فاراداي. يتصل مضخم تثبيت الرقعة بمحول رقمي في جهاز الكمبيوتر مع برنامج مخصص للحصول على البيانات. ولتوليد ومضة عالية الكثافة من الأشعة فوق البنفسجية، نستخدم مصباح وميض excelon.

يمكن تفعيل الومضة الضوئية يدوياً أو عن طريق الكمبيوتر باستخدام البرنامج نفسه الذي يتحكم في عملية الاستحواذ الفيزيولوجي الكهربائي. يتم اختيار أفضل الأطوال الموجية للتجارب الضوئية عن طريق إدخال مرشح UV في فتحة المخرج أو مصباح الومض. كما يمكن تعديل شدة الومضة الضوئية عن طريق تغيير الجهد الكهربائي أو سعة مصباح الومض.

يتم الحصول على تحكم أكثر دقة في شدة الضوء عن طريق وضع مرشحات الكثافة المحايدة في فتحة إخراج ثانية لمصباح الومضات. يتم توجيه ومضة الضوء إلى الخلايا العصبية المزروعة على أطباق ذات قاع زجاجي من خلال دليل ضوئي من ألياف الكوارتز. يتصل الدليل الضوئي بملحق الفلورية فوق المحورية للمجهر المقلوب.

باستخدام محول، يقوم مكعب ترشيح معدل وبدون مرشح إثارة بتوجيه حزمة الأشعة فوق البنفسجية UV إلى العصبون بواسطة مرآة عاكسة. يتم تركيز الضوء عبر عدسة شيئية غمر زيتية 100x. ويتم تصور المنطقة التي يغطيها النسيج عن طريق إدخال دليل الضوء في جهاز الإضاءة.

تُعرض الصورة على شاشة عبر كاميرا CCD متصلة بالمجهر. يتم رسم تحديد للمنطقة على الشاشة لتحديد موقع منطقة اللحم المعرضة للأشعة فوق البنفسجية (UV) لإجراء التجارب قبل التشريح، ثم تُجهز ثلاثة أطباق ذات قاع زجاجي مطلية بـ conna a و poly. وللتحضير لعملية التشريح، يتم ملء طبقين من أطباق بيتري بقطر 50 مليمتر مطلية بالسكر بمحلول رينجر.

ضعها على الثلج. قم بتبريدها أيضاً. امزج 0.5 milliliter من محلول مزيج الإيقاف مع المحقنة التي تحتوي على حوالي 10 milliliters من محلول رينجر.

ابدأ بالفأر الذي تم التضحية به. قم بإزالة الجلد المبطن للجمجمة، واقطع على طول خطوط الفك وضع الرأس في طبق بتري مطلي بالفضة. ضع الطبق تحت مجهر ستيريو واستخدم مشرطاً لإجراء شق سهمي.

قم بتشريح الرأس على طول الخط الناصف. أدر نصف الرأس بحيث يكون الجانب الإنسي للأعلى. قم بإزالة الحاجز بعناية للكشف عن النهايات.

نعرض هنا صورة مكبرة أثناء إزالة الحاجز باستخدام ملقط رقم 3 ومشرط. قم بإزالة النهايات المبطنة بالظهارة الدهنية بعناية. انقلها إلى طبق بتري آخر مطلي بالفضة باستخدام ملقط فائق الدقة رقم 55 والمشرط.

افصل قطع الظهارة الشمّية عن النهايات الأساسية الموجودة تحتها. انقل قطع الظهارة الشمّية إلى أنبوب يحتوي على 1 mL من محلول رينجر الخالي من الأيونات ثنائية التكافؤ. ثم أضف الباباين.

باستخدام مقصات دقيقة، يتم تقطيع الظهارة، ثم تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق، وتُقطع برفق مرة أخرى باستخدام المقصات الدقيقة. بعد الانتظار لخمس دقائق إضافية، تُنقل العينة باستخدام ماصة باستير مصقولة اللهب ذات فتحة واسعة إلى أنبوب يحتوي على محلول الإيقاف، ثم تُفصل مركزياً لمدة خمس دقائق، ويُتخلص من السائل الطافي. يُضاف حوالي 1 mL من محلول رينجر المفلتر، ويُقلب برفق باستخدام ماصة باستير مصقولة اللهب بقطر فتحة يبلغ حوالي 1 mm.

ضع المحلول الذي يحتوي على الخلايا في منتصف ثلاث أطباق زجاجية ذات قاعدة مسطحة، واترك الخلايا تترسب لمدة ساعة تقريباً عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أضف محلول رينجر.

اعمل في إضاءة خافتة لتجنب تحلل مركبات القفص بفعل الضوء المحيط. ضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الشيئية 100 x. ضع طبقاً واحداً بقاع زجاجي يحتوي على العصبونات الحسية المفتتة للـ oratory على منصة مجهر الفلورسنت المقلوب.

باستخدام محلول رينجر. قم بحماية المحقنة التي تحتوي على المحلول داخل الخلوي مع مركبات القفص من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم واحفظها مبردة. ابحث عن عصبون حسي شمّي معزول بأهداب سليمة.

حرك منصة المجهر لوضع منطقة Cary داخل المنطقة المرسومة على الشاشة. لتحديد منطقة وميض الأشعة فوق البنفسجية (UV)، املأ ماصة رقعة (patch pipette) بمحلول داخل خلوي يحتوي على المركب القفصي (cage compound). أدخل الماصة في حامل المرحلة الرأسية لمضخم Apache clamp.

باستخدام تقنيات تثبيت الرقعة (patch clamp) القياسية، اقترب من جسم العصبون باستخدام ماصة الرقعة (patch pipette) لتحقيق ختم جيجا (giga seal)، ثم انتقل إلى وضع الخلية الكاملة (whole cell mode) عبر جهاز الكمبيوتر.

ابدأ بروتوكول التحفيز وسجل الاستجابة. يقوم بروتوكول التحفيز النموذجي بتثبيت الجهد عند قيمة ثابتة وتحفيز إطلاق ومضة UV لتحلل مركب القفص. سنعرض لكم الآن بعض التسجيلات التمثيلية، حيث تظهر هنا استجابة عصبون حسي معزول من فأر لعملية تحلل cage cyclic AMP.

يشير السهم في الأعلى إلى وقت إطلاق ومضة UV. تم تسجيل التيار الذي تم تنشيطه بواسطة Cycl MP عند -60 millivolt في محلول رينجر منخفض الكالسيوم خارج الخلية. كانت مرحلة صعود التيار سريعة وتم تمثيلها باستخدام دالة أسية واحدة.

نرى هنا تسجيلاً من العصبون نفسه وهو مغمور في محلول رينجر العادي، الذي يحتوي على 1 mM من الكالسيوم. وقد أصبحت مرحلة الصعود للتيار عند -60 mV أقل بكثير ومتعددة الأطوار. ويعود ذلك إلى تأثير دخول الكالسيوم عبر قنوات C recycling P gated، مما يؤدي إلى تنشيط تيار كلوريد ثانوي.

في هذا المثال، قمنا بتثبيت الجهد عند 60 millivolt موجب. وهذه طريقة أخرى لتقليل تدفق الكالسيوم إلى الداخل. وقد تم وصف مرحلة الصعود في الاستجابة الناتجة عن cyclone PN caging عند 60 millivolt موجب بشكل جيد بواسطة دالة أسية واحدة، مما يشير إلى وجود مكون تيار واحد فقط.

يظهر مثال على الاستجابات التي تم الحصول عليها عن طريق التحرير الضوئي للكالسيوم داخل Celia؛ حيث يتم حمل هذا التيار بواسطة أيونات الكلوريد. كان الجهد -50 millivolt. وقد تم تحفيز استجابات ذات سعات متزايدة عن طريق التحرير الضوئي للكالسيوم المتقيد باستخدام ومضات UV ذات شدات متزايدة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية التسجيل من العصبونات الحسية المصنعية المفككة عند إجراء هذا الإجراء. من المهم تذكر ضرورة التحلي بصبر شديد. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في التجربة.