غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير

الهدف العام من هذه التجربة هو استزراع غرسات وعائية بخلايا سلفية بطانية مشتقة من دم ذاتي، ثم مراقبة تأثير هذا العلاج على التخثر في نموذج حيواني كبير. ويتحقق ذلك عن طريق الحصول على عينة دم محيطية من الخنازير لعزل الخلايا السلفية البطانية للخنازير ذات النمو المتأخر. تلي ذلك خطوة استخدام جهاز قابل للزرع.

توضع الخلايا الجذعية السلفية للبطانة (PCs) الذاتية داخل أنبوب التيتانيوم في دراستنا لإثبات المبدأ. ثم يُزرع الجهاز في الوريد الأجوف السفلي للخنزير. وتظهر النتائج وجود حماية ضد التخثر بناءً على نفاذية أنبوب التيتانيوم المزروع بـ EPC مقارنة بالمجموعة الضابطة وأنبوب المعدن العاري المسدود.

تلتزم جراحة ديوك (Duke surgery) بتعزيز البحوث المبتكرة والرائدة. ويعد العرض التقديمي التالي مثالاً على كيفية تعاوننا عبر الأقسام والتخصصات المختلفة للنهوض بالطب. حيث يقود الدكتور EK جهداً بحثياً لتطوير تقنية لتغطية الخلايا تمنع حدوث التجلط عن طريق تبطين السطح الملامس للدم في الأجهزة الوعائية باستخدام الخلايا السلفية الخاصة بالمريض.

بما أن هذه الخلايا قد استُمدت من المرضى أنفسهم الذين سيتلقون الزرع، فإننا نتجنب رفض الجهاز المناعي لها. إن نجاحنا والطرق الموصوفة هنا هي ثمرة جهد جماعي كبير. سيقوم شون غيج من قسم جراحة الأوعية الدموية، وويتني لين، طالبة الطب في جامعة ديوك، وأنا، بتوضيح عملية الزرع الجراحي.

أود الآن أن أقدم ألكسندر جانسن، طالب الدكتوراه من قسم الهندسة الطبية الحيوية، الذي سيطلعنا على عملية استزراع الخلايا بالتفصيل. سأقوم بتوضيح كيفية استزراع أنابيب التيتانيوم بالخلايا السلفية البطانية المشتقة من الدم مباشرة قبل زرعها في نموذج خنزيري. تعمل هذه الطريقة كإثبات للمفهوم، ويمكن تطبيق المبادئ الأساسية نفسها على العديد من الأجهزة القابلة للزرع الأخرى، مثل دعامات النيتينول وأجهزة المساعدة الدورية الميكانيكية. يتم عزل EPCs عن طريق زرع جزء الخلايا أحادية النواة من دم الخنازير، وتظهر عادةً بعد حوالي سبعة أيام.

يمكن التعرف عليها من خلال شكلها المورفولوجي النموذجي الذي يشبه رصف الشوارع. قم بتكثير الخلايا السلفية البطانية (EPCs) حتى يصل العدد الإجمالي إلى 9 million cells في المزرعة. اشطف الخلايا السلفية البطانية (EPCs) المُجهزة مرتين في وسط خالٍ من المصل، مع الحرص على تقليل تعرضها للضوء أثناء وبعد عملية الوسم.

ثم قم بتغطية الخلايا بعلامة فلورية، PKH 26 وسجل كمية المحلول المستخدمة. قم بتحضين الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. أوقف تفاعل الوسم بإضافة حجم مساوٍ من مصل الخنزير إلى محلول الصبغة بعد دقيقة واحدة.

قم بتخفيف المحاليل المجمعة بنسبة واحد إلى واحد باستخدام وسط نمو كامل. بعد ذلك، قم بشفط السائل وشطف الخلايا ثلاث مرات بوسط نمو كامل، يليه غسلتان باستخدام DPBS خالٍ من كلوريد الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد ذلك، غطِّ الخلايا بالتربسين مع تدوين الحجم المستخدم، ثم قم بتحضينها عند 37 درجة مئوية.

بعد ثلاث دقائق من التحضين، استخدم المجهر للتحقق من انفصال الخلايا، وفي حال انفصالها، أضف ضعف كمية محلول تحييد التريبسين التي تمت إضافتها سابقاً. بعد تحييد التريبسين، ادمج محاليل الخلايا في أنبوب واحد وقم بقياس كثافة الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). وأخيراً، قم بترسيب معلق الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في 4.5 milliliters على الأقل من الوسط الخالي من المصل.

بعد تحضير الخنزير للجراحة، يتم إجراء شق في الخط الناصف باستخدام شفرة مشرط رقم 15 بدءاً من المجموعة الثانية من الغدد الثديية. استمر في الشق وصولاً إلى المجموعة قبل الأخيرة بحذر باستخدام الكي الكهربائي. واصل التشريح نزولاً حتى الوصول إلى اللفافة البطنية.

ارفع البريتون باستخدام ملقط جراحي (mosquito forceps) وأحدث فتحة فيه بعناية باستخدام مقصات ميتز-أندال، ثم أخرج المثانة البولية للخارج وضع غرزة كيسية من خيط Vicryl قياس 3-0 في جدار المثانة. أحدث شقاً طعنياً في مركزها وأدخل قسطرة فولي قياس 16 French في الشق. بعد ذلك، قم بإعطاء سوائل وريدية لضبط نتاج البول بحيث لا يقل عن 1 mL/kg/h خلال الجراحة.

بعد ذلك، يتم إخراج الجزء المتوسع الصغير من الأمعاء خارجياً ووضع مباعدين جراحيين من نوع بور لكشف الجانب الخلفي للتجويف البريتوني وتحديد الوريد الأجوف السفلي IVC باستخدام التشريح الحاد والكليل. يتم تحرير الوريد الأجوف السفلي IVC بعناية من الأنسجة المحيطة. ثم يتم تعرية الوعاء الدموي بدءاً من الشريان الكلوي الأيمن وصولاً إلى المنطقة القريبة من تفرع الوريد الأجوف السفلي IVC في الجزء القاصي.

يجب توخي الحذر الشديد أثناء تشريح الوريد الأجوف السفلي (IVC)، حيث أن أي خلل بسيط جداً في الوريد الأجوف السفلي قد يؤدي إلى نزيف سريع وفقدان تام للدم في الحيوان المربوط. يتم ربط جميع الفروع الجانبية لقطعة الوريد الأجوف السفلي، مع إيلاء عناية خاصة عند تشريح وربط الوريدين القطنيين الخلفيين الكبيرين الموجودين مباشرة قبل تفرع الوريد الأجوف السفلي. وغالباً ما يوجد وريد قطني كبير على الجانب الخلفي.

قم بتسليك هذا الوريد وتحريره والسيطرة عليه باستخدام حلقات الأوعية الدموية (vessel loops). والآن، وبالتوازي مع العملية الجراحية، ابدأ باستزراع الغرسة بـ EPCs قبل البدء في هذا الإجراء. يجب أن تكون سقالات تثبيت أنسجة الأنابيب التيتانيومية مجمعة بالكامل وجاهزة للاستخدام في مجال معقم.

افتح مجموعة أنبوب التيتانيوم المعقمة بالغاز في محقنة سعة 5 cc. ثم قم بإزالة المكبس من المحقنة سعة 5 cc، ولكن لا تتخلص منه. ثبت غطاءً محكمًا في المحقنة. استخدم ماصة لملء المحقنة بمعلق EPC.

ثم أعد تركيب المكبس. قم بإزالة الغطاء وأدخل الطرف المستدق للمحقنة في أنبوب السيليكون المفتوح للتجميعة حتى يستقر بإحكام. ولكن دون مزيد من الضغط، قم بإزالة أي فقاعات عن طريق دفع محلول الخلية ببطء حتى يصل إلى الجزء العلوي من القطعة الرأسية.

ثم أغلق التجميع باستخدام غطاء لور (lure cap) وأحكم إغلاقه بالشريط اللاصق داخل قفاز معقم. أدخل هذا التجميع بالكامل في حامل محاقن مُصنّع وضعه في حاضنة عند 37 degree Celsius. استخدم مقياسًا للتأكد من استواء غرف التثبيت، واترك التجميع ليتحضن مع تدوير لطيف.

استكمل الجراحة مباشرة بعد ربط الوريد الأجوف السفلي (IVC) عن طريق إعطاء 100 units من الهيبارين لكل كيلوغرام من وزن الخنزير. بعد ذلك، قم فوراً بوضع مشبك على الوريد الأجوف السفلي بزاوية 45 درجة في الجهة القاصية من الوريد الأجوف السفلي والوريد القطني، ثم في الجهة الدانية. بعد ذلك، استخدم شفرة مشرط رقم 11 ومقصات تشريح لإجراء شق وريدي طولي بطول أربعة سنتيمتر بين المشبكين الداني والقاصي.

قم بتفريغ أي دم من الوريد الأجوف السفلي (IVC) واغسل تجويفه الداخلي بمحلول DPBS معقم. الآن، أدخل الغرسة التي تحتوي على خلايا EPC أو عينة تحكم معدنية مجردة في الوريد الأجوف السفلي لمنع جفاف الخلايا وتفريغ الهواء. املأ الوريد الأجوف السفلي بمحلول DPBS يحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

ثم أغلق فتحة الوريد باستخدام غرزة مستمرة من خيوط البرولين بمقاس 4-0، وقم بإزالة مشبك واحد من الجهة القريبة لتفريغ الهواء من الوريد الأجوف السفلي IVC من خلال السماح بحدوث نزيف خلفي بسيط. بعد النزيف، قم بإزالة المشبك القاصي لتثبيت الغرسة في مكانها. ثم ضع غرزة تثبيت في أنبوب PVC الممتد عبر جدار الوريد.

أغلق اللفافة باستخدام غرز OPDS على إبرة CT. ثم أغلق الحيز تحت الجلد باستخدام خيوط Vicryl 2-0 المستمرة. وأخيرًا، قم بتثبيت الجلد باستخدام الدباسة الجراحية.

يتم حقن ما يصل إلى 20 milliliters من 0.25%Marcaine تحت الجلد على طول موقع الشق، وتغطية الجرح بالشاش وtegaderm لتسكين الألم. يتم إعطاء flu Nixon وoxymorphone تحت الجلد حسب الحاجة. يتم إيقاف التخدير، وعندما يستيقظ الخنزير، يتم إعادته إلى قفصه على مدار الأيام السبعة التالية.

يتم إعطاء atri كل 24 ساعة كوقاية بالمضادات الحيوية، مع التأكد من بقاء رقعة fentanyl التي وضعت قبل الجراحة ملتصقة لمدة ثلاثة أيام إجمالاً. وبعد مرور ثلاثة أيام، تمت إزالة غرسات الأنابيب التيتانيومية المثبتة وفحص الأسطح الداخلية. وتحت طول موجي للإثارة يبلغ 550 nanometer، وُجدت طبقة متصلة من الخلايا الموصومة فلوروسنتياً في أنبوب آخر.

تم صبغ خلايا المقاطع إضافياً باستخدام علامة التصاق الخلايا البطانية بالصفائح الدموية لتصور حدود الخلايا. ويمكن استخدام مجموعة واسعة من الأصباغ في هذا الإجراء. وفي المقابل، يحدث انسداد كامل لغرسة أنبوب التيتانيوم العارية في بيئة قص منخفضة محفزة للتخثر في الوريد الأجوف السفلي.

كما هو موضح في الصورتين A وC، تظهر الأنبوبة التيتانيومية المستقرة في الخلية في الصورة B وقد ظلت خالية من الجلطات بعد إجراء عملية عزل الخلايا باستخدام الدم الوريدي. تظهر الخلايا السلفية البطانية (EPC) بعد متوسط سبعة أيام من الزرع. أثناء تنفيذ الإجراء الجراحي، من المهم جداً تسليك الوريد الأجوف السفلي (IVC) بعناية ورفق، لأن أي تمزق بسيط في الوريد الأجوف السفلي أو فروعه الجانبية قد يؤدي إلى نزيف حاد للخنزير. وعقب هذا الإجراء، يمكن للمواد الأخرى الملامسة للدم أن تكتسي بسرعة بالخلايا البطانية لمنع حدوث التخثر.

إن الدعامات الوعائية المبطنة بالخلايا البطانية، على سبيل المثال، باستخدام خلايا EPCs الخاصة بنا، تحاكي البطانة الأصلية لجدار الوعاء الدموي وقد تمنع تضيق الدعامة المتكرر والتخثر بعد تركيبها. ستسمح تقنية quick see الخاصة بنا بتبطين الأجهزة داخل الأوعية الدموية بالخلايا السلفية البطانية المستمدة من دم المريض نفسه في غضون دقائق داخل غرفة العمليات أو مختبر القسطرة. وبالتالي، يتم تجنب الزراعة الخارجية المطولة.

يتم تجنب قضاء وقت طويل على الجهاز نفسه، مما يجعل هذه التقنية عملية للتطبيق في الممارسة السريرية.