الجيل التجريبية للسرطان ، المرتبطين بها الخلايا الليفية (مقاهي) من الخلايا الليفية الثديية البشرية

يصف هذا الفيديو إجراءً لتوليد الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من مزارع أولية لخلايا بشرية. تُعد السرطانات الليفية أنسجة معقدة تتكون من خلايا ورمية وقسم غير سرطاني يُشار إليه باسم السدى (stroma). يتكون السدى المرتبط بالورم من مصفوفة خارج الخلية ومجموعة متنوعة من الخلايا السدوية، بما في ذلك الخلايا الليفية، والخلايا الليفية العضلية، والخلايا البطانية، والبيريسيتات، وكريات الدم البيضاء؛ وتكون الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان غنية بالخلايا الليفية العضلية، وهي سمة مميزة للخلايا الليفية النشطة الموجودة داخل الورم.

تلعب الخلايا السدوية دوراً رئيسياً في دفع التقدم الورمي. ويمكن توليد هذه الخلايا مخبرياً عن طريق عزل الخلايا الليفية الثدية البشرية الأولية أولاً من أنسجة الثدي السليمة التي يتم الحصول عليها عن طريق جراحة تصغير الثدي. ثم يتم تفكيك النسيج الذي تم الحصول عليه إلى معلق خلوي أحادي، ثم يتم تخليده عن طريق التنحي الفيروسي وهندسته وراثياً للتعبير عن GFP وجين مقاومة puram mycin.

يتم بعد ذلك حقن الخلايا بالتزامن مع خلايا سرطان الثدي البشري MCF7 تحت الجلد في فأر يعاني من نقص المناعة. ستتحول الخلايا الليفية البشرية المحقونة إلى خلايا ليفية عضلية محفزة للأورام.

بعد ذلك، يتم استخلاص أرومات ليفية ثدية بشرية أبوية من الطعوم الورمية الغريبة وزراعتها في وجود pur mycin. تُسمى الخلايا الناتجة المقاومة لـ pur mycin بأرومات ليفية مولدة تجريبياً أو exp calfs. ويكشف التحليل الكيميائي النسيجي المناعي أن الأرومات الليفية الثدية البشرية الطبيعية الموجودة في البداية تتطور إلى أرومات ليفية عضلية calf myofibroblasts داخل الطعم الورمي الغريب، والتي اكتسبت القدرة على تعزيز تكون الورم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل استخلاص cals الأولية من مرضى سرطان الثدي هي أننا قادرون على توليد calves تجريبياً من أرومات ليفية ثدية بشرية باستخدام الورم المزروع المشترك.

سيكون العارض العام لخطوات الإجراء كار، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، وأحمد كار، وهو طالب دكتوراه في المختبر. ابدأ بغرام واحد من أنسجة الثدي البشري السليمة المستأصلة من عملية تصغير الثدي. اغسل النسيج عدة مرات في PBS، ثم ضع النسيج في طبق بتري مقاس 15 سنتيمتر واستخدم شفرة حلاقة معقمة لتقطيعه إلى قطع صغيرة يقل حجمها عن 1.5 مليمتر مكعب.

بعد ذلك، استخدم شفرة الحلاقة لنقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من محلول تفكيك الخلايا لكل نصف جرام من الأنسجة. ثم قم بالرج باستخدام جهاز vortext لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. ضع الأنبوب على هزاز في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C واترك قطع الأنسجة لتتحلل لمدة تتراوح بين 12 و 18 ساعة.

في اليوم التالي، ستظل هناك العديد من قطع شظايا الأنسجة غير المهضومة متبقية في أنبوب الخلط الدوامي. أولاً، وبأقصى سرعة، ضع الأنبوب على سطح الطاولة واتركه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريك. بعد فترة الحضانة، استخدم ماصة فسيولوجية سعة 5 mL لنقل الطافي من سائل SUP المخصب بالخلايا السدوية الناتج إلى أنبوب مخروطي جديد.

ثم قم بطرد الجزء السدوي مركزياً لمدة خمس دقائق عند 250 ×g. وبعد الطرد، أعد تعليق الراسب الخلوي في PBS، ثم قم بطرد العينة مركزياً مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند 250 ×g. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في DMEM المكمل بـ 10% FCS وانقلها إلى طبق بتري بقطر 15 سنتيمتراً.

يتم تحضين الخلايا عند 37 °C و5% من ثاني أكسيد الكربون. وبعد مرور ثمانية إلى 10 أيام، يجب أن تصبح الخلايا متلاصقة (confluent). وفي هذه المرحلة، يتم حصاد الخلايا ويمكن تجميدها للتخزين طويل الأمد.

لإضفاء الخلود على الأرومات الليفية الطبيعية الأولية المستخلصة من الذاكرة البشرية، يتم إدخال ناقل retroviral P MIG الذي يعبر عن كل من H turt و GFP، ثم تُزرع الخلايا لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام، وبعد ذلك يتم فرز الخلايا الموجبة لـ GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم إدخال بنية retroviral P babe puro التي تشفر جين مقاومة pure mycin في مستنبت الأرومات الليفية المخلدة والموسومة بـ GFP. تُزرع الخلايا لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام في وجود pure mycin بتركيز نهائي قدره 1 µg/mL.

لعزل الخلايا الليفية الخالدة من الذاكرة البشرية المقاومة للـ PUR mycin والموسومة بـ GFP. بعد ذلك، يتم فحص ما إذا كانت الخلايا الليفية تنتج فيروسات نشطة، مما قد يؤدي إلى النقل الأفقي للجينات المشفرة لـ GFP والمقاومة للـ pur mycin. يتم استنبات 2.5 × 10⁵ من الخلايا الليفية الخالدة من الذاكرة البشرية المقاومة للـ pur mycin في طبق بتري بقطر 6 cm لمدة يومين.

قم بجمع وترشيح الوسط المكيف للخلايا الليفية باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.45 ميكرون. ثم أضف ذلك إلى خلايا ليفية للفئران من نوع 10 t and a half وازرعها لمدة 12 ساعة في وجود 5 µg/mL من كبريتات البروتين، مما يزيد من كفاءة الإصابة الفيروسية بعد مرور 12 ساعة. استبدل الوسط بوسط DMEM مكمل بـ 10% FCS وازرعها لمدة يومين إضافيين.

افحص الخلايا باستخدام المجهر الفلوري. ستكون 10 خلايا كاملة ونصف خلية مصابة بفيروس GFP موجبة لـ GFP. الآن، قم بتغيير الوسط لمعالجة الخلايا بتركيز 1 µg/mL.

قم بالتحضين في وسط يحتوي على pur mycin لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام. ثم قم بفحص الخلايا مرة أخرى باستخدام المجهر الفلوري لتحديد ما إذا كانت أي خلايا نصفاتن ونصف مقاومة لـ pur mycin قد شكلت مستعمرات. لاحظ أن نقل الجينات الأفقي بواسطة الفيروسات النشطة التي تنتجها الخلايا الليفية الثديية البشرية الموصومة بـ GFP والمقاومة لـ pur mycin قد يجعل الخلايا الفأرية وخلايا الكارسينوما المحيطة الحساسة لـ pur mycin مقاومة لها.

مقاومة الـ pur mycin وإيجابية الـ GFP داخل الطعم الورمي الغريب. قد يعيق هذا عملية عزل الأرومات الليفية الثديية البشرية المقاومة للـ pure mycin والموسومة بـ GFP والمحقونة من الطعم الورمي الغريب لإنتاج أرومات ليفية مرتبطة بالسرطان تجريبياً لحقنها في فأر ناقص المناعة. ابدأ بعملية التريبسين وعدّ الخط الخلوي للثدي البشري الذي تم تحضيره للتو جنباً إلى جنب مع الخط الخلوي لسرطان الثدي البشري MCF seven RAs في أنابيب ميكرو سنترفيوج جديدة.

قم بتعليق 1×10⁶ من خلايا سرطان الثدي البشري MC777 RAs و 3×10⁶ من الخلايا الليفية الثديية البشرية الخالدة المقاومة للبورمايسين والموسومة بـ GFP في 400 µL من وسط الزرع مع 50% matrigel لكل حقنة. ضع الأنابيب على الثلج كعينة ضابطة.

قم أيضاً بتحضير الخلايا الليفية الثديية البشرية نفسها دون خلايا MCF seven RAs. بعد ذلك، وباستخدام إبرة قياس 27، احقن خليط الخلايا في موقع تحت جلدي لفأر عارٍ ناقص المناعة لفحص التباين داخل الورم للأنماط الظاهرية لـ calfs. قم بعزل calfs والخلايا الليفية الضابطة من عدد قليل من الطعوم الورمية الغريبة المختلفة.

بعد ذلك، يتم زرع كل خليط في الجانبين الأيمن والأيسر من كل فأر. تُترك الطعوم الغريبة من الأورام أو الخلايا الليفية لتنمو لمدة 42 يوماً بعد الحقن. ويجب تحسين فترة حضانة الخلايا الليفية داخل الطعم الغريب الورمي بناءً على النمط الظاهري للخلايا الليفية العضلية المكتسب في الخلايا الليفية الأصلية الموجودة في الورم.

لاستخلاص الخلايا الليفية من العجول أو المجموعة الضابطة من الفأر الذي تم تخديره حتى الموت، ضع ما لا يقل عن 0.5 جرام من نسيج الطعم الغريب وما لا يقل عن 0.1 جرام من نسيج الطعم الغريب للخلايا الليفية في أطباق منفصلة. بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة معقمة لتقطيع النسيج إلى قطع نسيجية صغيرة يقل حجمها عن 1.5 مليمتر مكعب. ثم استخدم شفرة الحلاقة لنقل القطع النسيجية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على محلول تفكيك الخلايا، وقم بالرج بواسطة جهاز Vortex لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة، ثم قم بتحضين معلق الخلايا لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية مع التقليب البطيء المستمر، ثم قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا.

يتم الفصل إما من الورم أو من طعم ليفي زجاجي سليم لمدة خمس دقائق عند 250 ضعف الجاذبية بعد الدوران. أعد تعليق كتلة الخلايا في PBS وكرر عملية الطرد المركزي. ثم أعد تعليق كتلة الخلايا الناتجة في DMEM مضاف إليه 10% FCS لعزل مزرعة الخلايا الليفية الثدية البشرية الأبوية المقاومة للميوسين.

تُزرع الخلايا المشتقة من الورم أو الخلايا الليفية في أطباق بيتري بقطر 15 سنتيمتر في وجود 1 µg/mL من puromycin عند درجة حرارة 37 °C و 5% CO2. سيؤدي ذلك إلى القضاء على أي خلايا سرطانية أو خلايا فئران ملوثة.

يتم إكثار الخلايا السدوية حتى تصل إلى مرحلة التلاقي، ثم تُخزن الخلايا عند درجة حرارة -80 درجة Celsius باستخدام وسط تجميد. يرجى ملاحظة أن الخلايا الناتجة المقاومة للميوسين، والتي سُميت XP calf one بعمر 42 يوماً أو خلايا control fibroblast one، هي خلايا خالدة وإيجابية لـ GFP. تزيد الخلايا الليفية الذاكرة البشرية من نمطها الظاهري الليفي العضلي المروج للأورام داخل الطعم الورمي الغريب من خلال التفاعل مع خلايا الكارسينوما أثناء تطور الورم. اخلط 1×10⁶ من خلايا MCF seven RAs مع 3×10⁶ من خلايا 42 day old P calf.

ضع خلايا واحدة في 400 µL من وسط استزراع يحتوي على 50% matrigel لعملية الحقن في أنبوب centrifuge سعة 1.5 mL. قم أيضاً بتحضير 3 × 10⁶ من الخلايا الليفية الضابطة (control fibroblasts) بعمر 42 يوماً، وهي خلايا واحدة بدون خلايا سرطانية في أنبوب centrifuge لتعزيز الأنماط الظاهرية الليفية العضلية المحفزة للأورام في خلايا exp calf الواحدة. احقن خليطاً من هذه الخلايا مع خلايا CF seven RAs تحت الجلد في فأر عارٍ (nude mouse). كما يتم حقن الخلايا الليفية الضابطة الواحدة بمفردها بدون خلايا سرطانية لتحضير الخلايا الضابطة عند الحاجة.

قم بتحضين خلايا exp calf one لفترات إضافية تصل إلى 200 يوم داخل الطعم الورمي الغريب لتوليد خلايا exp C two لتعزيز النمط الظاهري الليفي العضلي المعزز للأورام. كما يجب توليد خلايا control Fibroblasts two كعينة ضابطة مقابل خلايا exp calf two عن طريق حقن خلايا control fibroblasts one بدون خلايا سرطانية في فأر، ثم إزالة الأورام ووضعها في أطباق الزرع النسيجي.

قم بتشريح وتفكيك طعم السنومرورمور الورمي أو الليفي إلى معلق من الخلايا المفردة واستزرعها. تُزرع الخلايا في طبق بتري مقاس 15 سنتيمتر باستخدام 10%F-C-S-D-M-E-M بوجود pur mycin، وتُترك الخلايا للتكاثر حتى يتم هضمها بواسطة trypsin ثم تُخزن الخلايا عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius باستخدام وسط التجميد. سُميت الخلايا الناتجة المقاومة لـ pur mycin باسم 242 day old exp calf two cells أو control fibroblasts two cells. تم تحليل خلايا GFP labeled exp calf two وcontrol fibroblasts two cells المستخلصة من طعوم الورم الثديي الغريبة كيميائياً نسيجياً كما هو موضح في هذه الصورة، حيث صبغت الخلايا إيجابية قوية للمؤشرات الميزنشيمية بما في ذلك fermenting prolo four hydroxylase collagen one A وfibronectin وS 100 وA four وبروتين سطح الخلايا الليفية النوعي للبشر.

تشير هذه النتائج إلى أن هذه الخلايا ذات أصل بشري وطبيعة ميزنشيمية. وفي المقابل، لم يظهر صبغ السيتوكيراتين، وهو علامة للخلايا الظهارية، في هذه الخلايا الليفية الموجبة لـ GFP عند النظر إليها مجتمعة. وتوحي هذه النتائج بأن خلايا EXP C two وخلايا control fibroblasts two نشأت من الخلايا الليفية الثديية البشرية الأبوية التي تم إدخالها في البداية في الطعوم الغريبة للفئران.

ومن الأهمية بمكان أن أعداداً أكبر بكثير من خلايا XP calf two صبغت إيجابياً لكل من alpha SMA والبروتين السكري للمصفوفة خارج الخلوية to nasin C، وكلاهما من علامات الخلايا الليفية العضلية مقارنة بخلايا control fibroblasts two. ويُلاحظ وجود نسبة أعلى من الخلايا الليفية العضلية الإيجابية لـ alpha smma في خلايا exp calf two مقارنة بما لوحظ في خلايا exp calf one التي يبلغ عمرها 42 يوماً. وتوضح هذه البيانات أن الخلايا الليفية الذاكرة البشرية المقيمة تتحول تدريجياً إلى خلايا calf myofibroblasts داخل الطعوم الغريبة للأورام أثناء تطور الورم بعد نموه.

مهد نموذج طعم الورم الخثاري التكميلي الطريق للباحثين العاملين في البيئة الدقيقة للورم لدراسة عمليات تطور الخلايا الليفية الطبيعية إلى خلايا سرطانية، أو ما يسمى بالخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان.